Ensaio de Dot Blot para quantificar o genoma viral

Para quantificar o DNA viral usando o ensaio de dot blot, comece com uma suspensão isolada de DNA viral. Trate com uma solução alcalina para desnaturar o DNA de fita dupla em fitas simples para hibridização subsequente.

Monte o aparelho de dot blot com uma membrana de náilon pré-umedecida. Carregue o DNA viral desnaturado e as soluções de DNA de plasmídeo padrão linearizado nos poços. Aplique um vácuo adequado, facilitando a transferência eficaz de DNA viral de fita simples com carga negativa e ligando-se à superfície da membrana carregada positivamente por meio de interações eletrostáticas, formando padrões de pontos.

Após a corrida, lave a membrana com tampão citrato de sódio, ajudando a melhorar a sensibilidade do ensaio. Após a secagem, exponha a membrana à luz ultravioleta, reticulando o DNA borrado com a membrana.

Adicione um fragmento de DNA não heterólogo desnaturado pelo calor e uma suspensão de sonda de DNA marcada com fósforo radioativo específica do genoma viral em tampão de hibridização à membrana. Incubar, facilitando a hibridização.

Os fragmentos de DNA atuam como agentes bloqueadores, ligando-se às demais regiões da membrana, minimizando a ligação não específica da sonda. A sonda radioativa hibridiza com a sequência complementar no DNA viral de fita simples.

Lave com tampão de lavagem para remover sondas não hibridizadas. Usando o sistema de varredura de imagem de fósforo, quantifique os sinais radioativos emitidos pelas sondas radioativas hibridizadas com o genoma viral na membrana, para obter sinais de dot blot.

A partir da curva padrão, a intensidade do sinal de cada ponto na membrana pode ser usada para calcular a quantidade de DNA viral na amostra.