Dot Blot quantitativo para estimar proteínas-alvo em um lisado tecidual

O dot blot quantitativo - ou QDB - é uma técnica útil para quantificar a concentração de proteínas-alvo em uma amostra. Uma vez que a amostra é imobilizada em uma membrana polimérica, as proteínas podem ser detectadas por immunoblotting.

Para começar, pegue uma placa QDB - uma placa de vários poços com uma membrana de nitrocelulose presa ao fundo de cada poço. Adicione a amostra - um lisado de tecido contendo a proteína alvo - no centro da membrana dentro do poço.

Deixe a amostra secar. A proteína alvo se liga à membrana por meio de interações não covalentes.

Adicione uma solução de bloqueio. As proteínas da solução se ligam aos locais não ligados na membrana, impedindo a ligação não específica de reagentes de detecção.

Em seguida, adicione uma solução contendo anticorpos primários que se ligam à proteína alvo na amostra. Lave para remover anticorpos não ligados.

Em seguida, adicione uma solução secundária de anticorpos. Essas moléculas - marcadas com uma enzima peroxidase - se ligam aos anticorpos primários ligados às proteínas. Lave para remover anticorpos não ligados.

Por fim, adicione uma solução contendo um substrato quimioluminescente e peróxido de hidrogênio. Utilizando peróxido de hidrogênio, a peroxidase ligada ao anticorpo oxida o substrato e emite luz. Usando um leitor de placas, meça a intensidade de luminescência da amostra.

Gerar uma curva de luminescência padrão usando uma diluição em série com concentrações conhecidas da proteína alvo. Representar graficamente o valor de luminescência medido da amostra na curva para determinar a concentração da proteína alvo.