Western blotting quantitativo para estimar os níveis de expressão de proteínas

O western blotting quantitativo - uma técnica baseada na normalização total de proteínas - é útil para quantificar os níveis de expressão da proteína-alvo.

Para começar, carregue o lisado de tecido nos poços de um gel gradiente de poliacrilamida. O lisado contém a proteína alvo, juntamente com outras proteínas celulares.

Execute o gel em uma tensão apropriada para a separação eletroforética das proteínas da amostra ao longo do gradiente. Após a conclusão, coloque o gel em cima da membrana polimérica de uma pilha de transferência.

Aplique uma corrente elétrica para transferir as proteínas separadas para a membrana. Em seguida, coloque a membrana em uma coloração fluorescente de proteína total. As moléculas de corante carregadas na mancha se ligam eletrostaticamente a todas as proteínas da membrana.

Adicione uma solução de bloqueio. As proteínas da solução se ligam à membrana, assim. impedindo a ligação não específica dos reagentes de detecção. Adicione um anticorpo primário ligando-se apenas à proteína alvo. Em seguida, adicione um anticorpo secundário - marcado com um fluoróforo - que se liga ao anticorpo primário.

Excite a amostra com um laser. Registre a fluorescência emitida pelas moléculas de corante da coloração total da proteína e dos fluoróforos ligados a anticorpos em seus comprimentos de onda correspondentes.

Para calcular o valor de carga de proteína normalizado, divida o sinal de proteína total de cada pista pelo valor mais alto. Divida o sinal da proteína alvo pelo valor de carga normalizado correspondente para determinar a expressão relativa da proteína alvo.