Ensaio de Western Blot Quimioluminescente para Processamento de Proteínas

O CD95 - um receptor de morte - liga-se a seus anticorpos agonísticos, desencadeando a montagem de um complexo de sinalização indutor de morte, ou DISC - um complexo multiproteico que recruta procaspase 8. No DISC, a procaspase 8 dimeriza e processa para formar vários produtos intermediários de clivagem e, finalmente, uma forma ativa que inicia a apoptose.

Para analisar o processamento da caspase-oito usando western blotting quimioluminescente, pegue um lisado contendo produtos de clivagem intermediários associados ao DISC da caspase 8 em um tubo. Complemente isso com anticorpos anti-CD95 capturados por esferas de proteína A-agarose. Os anticorpos anti-CD95 se ligam ao componente DISC ― CD95, formando complexos proteicos.

Carregue a amostra em um gel de poliacrilamida SDS para separar os intermediários da caspase 8 imunoprecipitada de diferentes tamanhos como bandas distintas. Coloque o gel em uma membrana de blotting e aplique uma corrente elétrica. Os intermediários da caspase 8 saem do gel para a membrana de blotting.

Trate a membrana com uma solução contendo proteínas de bloqueio para saturar os locais de ligação às proteínas - evitando ligações inespecíficas.

Adicione uma solução de anticorpos primários, que se ligam aos produtos da caspase-oito em um local específico.

Adicione anticorpos secundários marcados com enzimas que se ligam especificamente à região Fc complementar do anticorpo primário para formar um complexo de produto de clivagem caspase-oito - anticorpo primário - anticorpo secundário.

Adicione um substrato quimioluminescente que reaja com a enzima conjugada com anticorpos secundários e emita luz. A intensidade da luz emitida se correlaciona com a quantidade de produto de clivagem caspase-oito.