Southern Blotting para detectar recombinação homóloga no genoma de células-tronco embrionárias de camundongos

O Southern blotting envolve a identificação de sequências específicas de DNA de uma mistura complexa de DNA por meio de detecção baseada em sonda.

Para identificar recombinação homóloga ou eventos de HR em células-tronco embrionárias de camundongos com Southern blotting, obtenha DNA genômico das células. Incubar com uma enzima de restrição para digerir o DNA em fragmentos menores.

Carregue o DNA em um gel de agarose. Realize eletroforese para separação de fragmentos com base no tamanho.

Trate o gel com uma solução ácida para remover as bases purinas, soltando o DNA de fita dupla, dsDNA. Adicione a solução desnaturante alcalina. O pH alto interrompe as ligações de hidrogênio, desnaturando o dsDNA solto em DNA de fita simples, ssDNA. Incubar com uma solução neutralizante para neutralizar o pH do gel.

Monte o sistema de transferência usando papéis mata-borrão, uma membrana de náilon e gel empilhado em cima da membrana. Execute a transferência. O ssDNA é transferido do gel para a membrana por ação capilar descendente.

Irradiar a membrana com raios ultravioleta, reticulando e imobilizando o DNA. Coloque a membrana em um tubo contendo uma solução de hibridização. Incubar com rotação, revestindo a membrana e evitando a ligação inespecífica da sonda.

Finalmente, incube a membrana com o tampão de hibridização contendo sondas marcadas radioativamente de fita simples. As sondas se ligam a regiões específicas de DNA por meio da complementaridade de sequência.

Lave a membrana, removendo as sondas não ligadas. Exponha a membrana aos raios X. Bandas distintas na membrana distinguem as regiões de DNA contendo eventos HR das regiões de controle.