PCR digital baseado em chip em tubo para quantificação de variantes de nucleotídeo único

Adicione primers, sondas e DNA genômico previamente projetados a uma nova tira de 8 tubos, para obter um volume total de 15 microlitros. Pipete para cima e para baixo para misturar.

Adicione a plataforma de carregamento aos cavacos construídos na nova tira de 8 tubos e, em seguida, coloque a tira de tubos no carregador automático. Certifique-se de que haja um contato entre os cavacos e a plataforma de carregamento. Em seguida, coloque o controle deslizante de carregamento na plataforma e use uma rolha para segurar o controle deslizante fora do carregador. Pipete 15 microlitros da mistura de PCR perto da ponta do controle deslizante e, em seguida, pressione o botão do carregador para operar o carregador por 1 minuto.

Remova a tira de tubo da carregadeira após a execução e coloque-a no intensificador de vedação. Empurre cuidadosamente a tampa deslizante e a borda da tampa superior. Execute o intensificador de vedação por aproximadamente 2 minutos. Se a vedação estiver incompleta, indicada por uma poça de líquido, repita a corrida por mais um minuto.

Adicione 230 microlitros de fluido de vedação aos tubos. Coloque a tira de tubo no termociclador e execute a PCR conforme descrito no protocolo. Se houver uma distribuição desigual de partições positivas, ajuste a temperatura ou a duração da PCR.

Para detectar e analisar a intensidade de fluorescência dos produtos de PCR, coloque a tira de tubo no gabarito de detecção e adicione 6 mililitros de água destilada. Remova quaisquer bolhas de ar visíveis usando uma ponta de pipeta.

Carregue o gabarito no detector. No software de detecção, selecione as guias "Fluorescência", "Experimento" e depois "Amostra/NTC" e clique no botão "Executar" para iniciar a execução. Após a execução completa, confirme o gráfico de posição, o histograma e o gráfico de dispersão 2D.

Para coletar o produto de PCR, remova o fluido de vedação do tubo. Adicione 100 microlitros de tampão TE e vortex vigorosamente por 30 segundos. Centrifugue brevemente os tubos em uma centrífuga de mesa e proceda conforme descrito no protocolo de texto, para concluir a coleta do produto de PCR.