Southern Blotting para detectar recombinação homóloga no genoma de células-tronco embrionárias de camundongos

Para cada gDNA, misture 30 microlitros de tampão 10X para Dra I, três microlitros de Dra I e 10 microgramas de gDNAs por amostra. Adicione água até que o volume final seja de 30 microlitros e incube a 37 graus Celsius durante a noite para digerir os gDNAs.

Prepare um gel de eletroforese de agarose a 1% com brometo de etídio. Carregue as amostras adquiridas anteriormente junto com uma escada de 1 Kb no gel e execute-o a 30 a 40 volts durante a noite. No dia seguinte, mergulhe o gel em uma bandeja, contendo uma solução de ácido clorídrico 0,2 Newton. Use uma coqueteleira para agitar a bandeja suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente.

Transfira o gel para uma bandeja contendo uma solução desnaturante de DNA. Agite suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira o gel para uma bandeja contendo uma solução neutralizante de DNA e agite-o suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente. Usando um sistema de transferência rápida para baixo, transfira os DNAs do gel para a membrana.

Em seguida, monte o TurboBlotter e a pilha de borrões conforme descrito nas instruções fornecidas pelo fabricante. Depois disso, retire a membrana e lave-a com citrato de sódio 2X por um minuto. Absorva o líquido com os tecidos e, em seguida, use um reticulador UV para reticular o DNA com a membrana.

Para começar a rotular as sondas de DNA com radioatividade, adicione os DNAs da sonda desnaturados pelo calor ao tubo que contém as esferas de marcação de DNA prontas para uso. Pipete para cima e para baixo para misturar e adicione 5 microlitros de trifosfato de desoxicitosina marcado radioativamente. Incube a 37 graus Celsius por quinze minutos. Purifique as sondas rotuladas usando microcolunas G-50, de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Use um contador de cintilação para medir a radioatividade.

Para começar a hibridizar as membranas com as sondas marcadas, coloque a membrana no tubo de hibridização. Adicione a solução mista de pré-hibridização. Coloque o tubo no forno de hibridização e deixe a pré-hibridização prosseguir a 42 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, retire o tubo do forno e despeje a solução de pré-hibridização em um tubo de 50 mililitros. Adicione a sonda desnaturada e misture delicadamente. Adicione a solução de hibridização mista no tubo de hibridização e retorne o tubo ao forno de hibridização. Em seguida, deixe a hibridização prosseguir durante a noite.

Para remover as sondas não hibridizadas, coloque a membrana em uma bandeja contendo 1x citrato de sódio salino com 0,1% de SDS e agite suavemente a 55 a 60 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, enrole a membrana com filme plástico e fixe-a no de exposição. Em uma sala escura, exponha a membrana a 2 folhas de filme de raios-X. Revele o filme para visualizar os resultados.