Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

Células-tronco cancerígenas ou CSCs possuem a capacidade de autorrenovação de longo prazo e a habilidade de produzir descendentes diferenciados. As CSCs foram identificadas em um número crescente de neoplasias malignas, incluindo o adenocarcinoma pancreático, no qual podem ser identificadas com base na atividade de aldeído desidrogenase e na expressão de antígenos de superfície celular, CD 44, CD 24 e CD 1 33. Aqui, tumores são isolados de camundongos portadores de câncer pancreático humano.

São gerados xenografismos e suspensões de células individuais. As células são então coradas com o reagente eldor, que identifica células com alta atividade de aldeído desidrogenase e antígenos de superfície celular CD 44 e CD 24. As populações de células-tronco cancerígenas são então isoladas utilizando triagem de células ativada por fluorescência.

As células isoladas podem ser utilizadas em diversos ensaios funcionais e analíticos posteriores. A hipótese das células-tronco é uma área emergente na biologia do câncer. Essencialmente, a hipótese afirma que os tumores contêm subconjuntos distintos de células com fenótipos e funções diferentes.

Subconjuntos específicos de células, denominados células iniciadoras de tumor ou células-tronco cancerígenas, podem gerar tumores em camundongos imunodeficientes ou colônias em ensaios congênicos in vitro. Mais recentemente, acredita-se que as células-tronco cancerígenas também desempenhem um papel importante no desenvolvimento de metástases, bem como na resistência terapêutica. Originalmente, as células-tronco cancerígenas foram estudadas em leucemias mieloides utilizando amostras de sangue periférico ou de medula óssea.

No entanto, com o surgimento da biologia de células-tronco e dos tumores sólidos, surgiu o desafio de gerar suspensões de células individuais que possam ser separadas por citometria de fluxo e posteriormente analisadas em aplicações a montante. Meu colega pós-doutorando Zan demonstrará agora este procedimento. Demonstrarei visualmente várias etapas críticas durante este protocolo.

Começando com a geração de uma suspensão simples de células tumorais a partir de um xenoenxerto de câncer pancreático humano. Em seguida, vou corar as células para atividade de aldeído desidrogenase e vários antígenos de superfície celular. Finalmente, vou separar as células utilizando um classificador de células ativado por fluorescência.

Os camundongos utilizados para este protocolo abrigam xenografias subcutâneas de câncer pancreático humano. Esses camundongos foram previamente gerados da seguinte maneira. Tumores recém-coletados de pacientes submetidos à cirurgia por adenocarcinoma pancreático no Hospital Johns Hopkins foram picados em fragmentos de dois a três milímetros e implantados subcutaneamente nas laterais de camundongos atímicos de seis semanas de idade.

Quando os tumores tinham aproximadamente 1,5 centímetros cúbicos, eles foram ressecados e transplantados para camundongos receptores secundários para expandir o pool de tumores. Este protocolo começa com a coleta de um tumor subcutâneo do flanco de um camundongo anêmico por dissecação romba. Após a remoção do tumor, coloque-o imediatamente em tampão de dissociação celular.

Em seguida, pese o tumor e, então, coloque-o novamente em 10 mililitros de tampão de dissociação celular por um grama de tecido tumoral, trabalhando em uma cabine de segurança biológica estéril. Transfira o tumor para uma placa de cultura de 100 por 20 milímetros contendo um mililitro de tampão de dissociação celular, utilizando lâminas de barbear e pinças estéreis. Pique o tumor mecanicamente.

Transfira a suspensão de células tumorais para um tubo cônico de 50 mililitros contendo o volume restante do tampão de dissociação celular. Em seguida, pipete a suspensão de células tumorais 10 vezes com uma pipeta serológica de cinco mililitros. Os fragmentos tumorais devem ser pequenos para que não obstruam a pipeta serológica de cinco mililitros e, então, vortexe a suspensão na velocidade máxima por um minuto.

Em seguida, incubar a suspensão de células tumorais a 37 graus Celsius por duas horas, fazendo vortex por um minuto a cada 20 minutos. Após a incubação de duas horas, fazer vortex da suspensão celular em velocidade máxima por um minuto. Passar a suspensão de células por um filtro de 70 mícrons e coletá-la em um novo tubo cônico de 50 mililitros.

Ajuste o volume final para 15 mililitros com DMEM contendo 10% de FBS e pen strep para separar ainda mais as células viáveis de células mortas e detritos teciduais. Pipete 15 mililitros de Ficoll-Paque Plus lentamente abaixo da suspensão celular para preparar um gradiente de Ficoll para separação por centrifugação em densidade. Tenha cuidado para não misturar as duas camadas. Centrifugue a 500 ×g por 30 minutos à temperatura ambiente com o freio desativado. Após a centrifugação, as células viáveis estarão na interface entre o Ficoll-Paque Plus e o tampão de dissociação celular.

Transfira-os para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione DMEM fresco suplementado com 10% de FBS à suspensão celular para diluí-la na proporção de um para três, centrifugue as células isoladas a 450 ×g durante 10 minutos à temperatura ambiente; após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão alor, fornecido no kit de coloração alor e que será utilizado nas etapas subsequentes de coloração celular. Em seguida, dilua 10 microlitros da suspensão celular com 10 mililitros de azul de trian e conte as células viáveis utilizando um hemocitômetro.

Se um grande número de células mortas ou detritos teciduais for observado durante esta etapa, repita a separação celular. A separação por centrifugação em gradiente de densidade permitirá a coloração das células para atividade de aldeído desidrogenase. Utilizando o reagente AldeFluor, as células também serão coradas para diversos antígenos de superfície celular com anticorpos conjugados a fluoróforos específicos.

Rotule sete tubos de ensaio de poliestireno de 12 por 75 milímetros e coloque-os no gelo. Dilua a suspensão celular em dois mililitros de tampão eldor até uma concentração final de cinco a 10 milhões de células por mililitro e mantenha-a no gelo. Em seguida, de acordo com as instruções no protocolo escrito fornecido, prepare as seguintes amostras para ajustar os controles de compensação no fax area.

Primeiro, analise as células-controle não coradas com ST no citômetro de fluxo. Em seguida, analise as células coradas com CD44 APC. Terceiro, analise as células coradas com CD24 PE e quarto, as células coradas com biotina anti-CD31 murino, biotina anti-linhagem murina, biotina anti-H2KD murino e estreptavidina PerCP. Prepare também uma quinta amostra contendo apenas ALOR e uma sexta amostra para definir os gateamentos positivos para ALDH, CD44 positivo e CD24 positivo.

Esta amostra conterá ELDOR DEAB, um inibidor da aldeído desidrogenase, e anticorpos isotópicos de controle. IgG dois B kappa a PC IgG dois a kappa PE camunduco CD 31 biotina camunduco linhagem, biotina camunduco, H dois KD, biotina e estreptavidina por cp. Em seguida, no tubo final, marque as células com alor CD 44 A PC CD 24 PE camunduco CD 31 biotina camunduco linhagem, biotina camunduco, H dois KD, biotina e estreptavidina por cp.

Este é o espécime real a ser classificado após a conclusão de todas as colorações; mantenha os tubos sobre gelo e no escuro até que a classificação celular seja realizada. Este protocolo de classificação resultará no isolamento de CSE pancreáticas positivas para LDH A, CD44 positivas e CD24 positivas. Imediatamente antes da classificação, adicione dois miligramas por mililitro de iodeto de propídio ao tubo de seleção positivo para LDH A, CD44 positivo e CD24 positivo, para excluir células não viáveis utilizando como controle de compensação as células linfoides de camundongo não coradas com ST, CD44 APC, CD24 PE e células alor em um citômetro de fluxo FIA.

O citômetro gera portas com base nos parâmetros de dispersão direta e lateral para coletar sinlgetos celulares. Utilize os tubos não corados com ST e os tubos de linhagem murina para criar uma porta para células viáveis negativas para CP e negativas para iodeto de propídio, utilizando o canal FL3. A maioria dos xenoenxertos de câncer pancreático humano contém de 20 a 60% de células derivadas de camundongo, utilizando o coquetel de linhagem murina CD31 e H2kd murino.

Anticorpos conjugados com biotina utilizando células tratadas com DEAB geram portas no canal FL1 para células positivas para A LDH. A frequência da população positiva para A L DH em diferentes xenografias é variável, mas geralmente corresponde a 1 a 4% da população total de células. Em seguida, coloque as células para separação no compartimento de fax e utilize essas portas.

Colete células positivas para LDH em tubos de ensaio de poliestireno de 12 por 75 milímetros contendo um mililitro de DMEM suplementado com 10% de FBS. Em seguida, crie gates utilizando células coradas com IgG Eldor 2B kappa a PC e IgG 2a kappa PE nos canais FL4 e FL2. Então, colete as células CD44 positivas e CD24 positivas, que geralmente representam de 0,2 a 5% da população total após cada população celular ter sido separada.

Centrifugue a suspensão celular a 450 G durante 10 minutos e re-suspenda as células em 500 mililitros de DMEM fresco suplementado com 10% de FBS; conte o número de células classificadas utilizando um hemocitômetro. Este procedimento resultará no isolamento de Células-Tronco Cancerígenas pancreáticas viáveis. Essas células podem ser utilizadas em diversos ensaios analíticos e funcionais que exijam células viáveis.

Utilizamos-nos deles para medir o crescimento clonogênico e a invasão in vitro. Utilizamos-nos deles para medir a iniciação tumoral e a formação de metástases in vivo, e utilizamos-nos deles para realizar análises genéticas comparativas. Após dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente sete horas.

Existem várias etapas essenciais para obter uma população pura de células viáveis. Primeiro, xenografias com menos de um centímetro no maior diâmetro terão a menor quantidade de tecido necrótico dentro dos tumores. Isso garantirá a menor quantidade de células não viáveis e debris tecidual contaminando sua população final de células isoladas.

Segundo, ao gerar uma suspensão única de células tumorais, é importante trabalhar rapidamente e manter as células ou o tumor em meio suplementado com 10% de soro para aumentar a viabilidade celular. Terceiro, uma vez iniciada a marcação celular com o reagente alde Fluor e os anticorpos, é fundamental manter as células sobre gelo e mantê-las no tampão alor para reduzir a quantidade de influxo do reagente alor para fora das células. Além disso, é importante manter as células ao abrigo da luz o máximo possível para reduzir a quantidade de fotodegradação dos fluoro fours.

Por fim, é importante contar manualmente as células utilizando um hemocitômetro, já que o citômetro de fluxo frequentemente fornece contagens de células imprecisas.