Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

Eu sou você. Estou trabalhando no Anton James'lab. Hoje vou mostrar como fazer microinjeção em embriões ADIs do Egito com o objetivo de obter mosquitos transgênicos.

Para obter os embriões para micro injeções, precisamos ter a fêmea alimentada com sangue. As fêmeas deveriam ser alimentadas na quinta-feira. Se você quiser fazer uma microinjeção de segunda a sexta-feira, isso também é vil.

Estou pegando o algodão e colocando e despejando a água. O algodão deve estar molhado e pegar um círculo de homem branco de três mm, colocar no topo e empurrar para baixo. E preciso derramar a água, limpar o telhado, o guardanapo e fechar com algodão.

Agora vou coletar seis fêmeas 10 e transfiro fêmeas para se retirar por pouco tempo e vou colocá-las em condições escuras e colocá-las na câmara, que tem 27 graus celam por uma hora e 15 minutos. Estou fazendo agulhas para microinjeção usando agulhas de vidro e estamos usando a corporação de instrumentos de transporte polar e o modelo P 87. Eu coloco uma agulha de vidro no anel e fixo de ambos os lados.

Feche a tampa e a agulha push pull é vermelha. Agora vou mostrar como fazer o elo das agulhas. As agulhas após puxar são fechadas e precisamos reabrir as agulhas.

Existem duas maneiras de fazer isso. Uma maneira é ser link e outra maneira apenas tocar o embrião antes das injeções. Ok, este é o jeito Lin.

Eu tenho a agulha e conserto essa agulha aqui. Aqui está um acima da ponta que não podemos usar para micro injeção. Esta dica para micro injeção, precisamos ter a ponta aberta.

Esta é a roda. Eu tento tocar a superfície da roda com a agulha e as pontas das agulhas têm que tocar a superfície da roda. Quando a ponta toca a superfície, você tem que colocar a roda.

Aqui você pode ver que a agulha está pronta para microinjeção. A ponta da agulha é ser e você pode ver que a ponta está brilhando. Isso significa que a agulha está aberta e pronta para microinjeção.

Lembre-se, apenas a extremidade do tubo deve ser quebrada. Se você fizer um buraco grande, a agulha não está boa. O buraco tem que ser muito pequeno.

Uma hora e 15 minutos se passaram E os embriões devem estar prontos para as microinjeções que estou tirando da câmara. Leve um tempo e você pode ver embriões, uma dose preta no papel e agora estou transferindo fêmeas para a gaiola. Apenas deixe-os voar.

Agora vou mostrar as ferramentas que vou usar para embriões de alinhamento. Isso força que estou usando para tirar o papel X do selvagem. Isso força que estou usando para fazer a linha de embrião.

O César, precisamos cortar fita adesiva dupla e isso força que estou usando para retirar os ovos após micro injeções. Esta é a lamínula. Para esta guia de capa.

Eu coloco uma fita adesiva dupla para pegar embriões do papel watman. Agora vou alinhar embriões. O primeiro eu estou pegando papel X do tempo.

Você tem que lembrar que o papel o tempo todo tem que estar molhado. Vou alinhar embriões de cinza a cinza escuro. Este é um bom estágio para injeções.

Não pegue embriões brancos e pretos, todos os embriões devem estar na mesma orientação. Temos dois pólos, Ontário e pôster que vamos injetar no Posterial.End. O lado de Ontário é um pouco mais largo do que o posterior.

Esta é uma lamínula. Vou fazer uma lamínula pronta para pegar embriões. Para isso, preciso de fita adesiva dupla presa à capa.

Deslizamento, corte, envelhecimento e lamínula está pronto. No momento, preciso secar muito bem o papel X porque, se os embriões estiverem molhados, eles nunca grudam na fita. Para isso, estou usando MV sem secagem. No momento, estou pegando lamínula e fita adesiva dupla e pressionando levemente os embriões.

E eu tenho embriões na lamínula. E agora é essa etapa de dicação. Esta etapa de dicação terá que esperar nesta posição cerca de um minuto, talvez.

Mas você tem que olhar pelo microscópio e ver que os ovos começam a encolher. Esses embriões são dessecados. Você pode ver as covinhas e quando você vê essas covinhas, você tem que colocar óleo imediatamente e parar a dessecação.

Quando os embriões são dessecados, você deve colocar óleo imediatamente. Embriões estão prontos para microinjeção E estou colocando embriões de linha no palco e vou encher agulhas, DNA para isso. Estou usando o tubo de acréscimo e a agulha de carregamento também do acréscimo daqui.

E estou pegando meu DNA tomando 1,5 microlitro. Ok, carregue e a agulha e eu fixei a agulha no suporte. E hol está conectado ao micro injetor.

Estamos usando o micro injetor einor, que chama Femto jet. Agora estou pronto para injetar os embriões. Para este artigo, estamos usando pressão de injeção 600, contrapressão 250 e o tempo é manual.

Agora eu vejo embriões muito perfeitos no microscópio. E depois disso eu movo a agulha e também tenho que ver muito perfeitamente e focar a agulha no microscópio. Depois disso, coloco de volta os embriões e posso ver embriões e agulhas no mesmo campo.

E agora prender a agulha bem perto da extremidade posterior dos embriões. E estou fazendo injeção na extremidade posterior dos embriões. E primeiro o que estou fazendo, primeiro tenho que ver embriões muito claros no microscópio.

Eu movo o estágio do microscópio e sempre vejo onde a agulha não se move. Boa injeção. A injeção perfeita.

Quando você vê a extremidade posterior e alcança uma agulha, toca a parte posterior e você a penetra e não consegue ver nenhum encolhido do X, nenhum encolhido assim. Se você gosta disso, não é muito bom. Mas se x ainda estiver na posição assim e você penetrar na agulha, Isso significa que sua agulha é muito boa e a injeção é muito boa.

Após a microinjeção, preciso transferir os EMREs, nas condições úmidas. Para isso, estou usando uma câmara de plástico com algodão úmido no fundo e papel molhado. Eu coloco isso no algodão e tenho certeza de que este papel está molhado.

Isso está pronto. Estou tomando minha força. Estou ensinando os embriões sob óleo e colocando na parede o papel.

Por favor, não coloque no fundo porque o óleo tem que descer do embrião e eu, estou pegando 2, 3, 5 embriões de uma só vez ou um, também está tudo bem. Agora vou preparar embriões para estarem prontos para o insetário. Para isso estou pegando um lenço umedecido, cubro os embriões e fixo com borracha.

E isso está pronto para insetos por cinco dias. Em seguida, mantemos no Inspect por cinco dias e depois disso vamos chocar com o embrião, eh, e pegar os transgênicos. Agora estou em ECT e vou mostrar como eclodir os embriões.

E o primeiro eu vou derramar água na câmara de plástico e adicionar a comida. Gotas de casal, pegue os embriões, que ficam em um alimento insetorial cinco dias. Pegue o papel do ovo, faça um pequeno furo e coloque os embriões no chão.

É isso. Os embriões começam a eclodir após a primeira semana. E também alguns embriões começam a eclodir após quatro semanas.

E sempre temos na areia, diferentes estágios de larva e pu, eu só tenho mostrado para você como fazer microinjeção em embriões dete. E eu quero dizer que três etapas são muito importantes neste procedimento. Você tem que fazer agulhas muito boas.

Você tem que pegar embriões no estágio certo. A dessecação também deve ser feita com muita precisão, não muito. Em cerca de quatro semanas, teremos mosquitos transgênicos.