Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

O objetivo deste procedimento é expressar receptores de células T específicos do antígeno funcional em células T de camundongo. Primeiro, transfectar uma linha celular produtora de retrovírus com plasmídeo contendo o gene TCR de interesse para empacotar o retrovírus que expressa TCR. Em seguida, isolar e purificar as células T do baço de camundongos infecta essas células T purificadas com o retrovírus produzido na primeira etapa.

Finalmente, expanda as células T transduzidas para expressar e obter níveis apreciáveis de receptor. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão de TCRs específicos de antígenos funcionais em células T de camundongos por meio de citometria de fluxo. Olá, meu nome é Michelle Crow Guard.

Estou no Instituto do Câncer da NYU na NYU Medical School. Hoje vamos mostrar como transduzir células T primárias, as pessoas que mostrarão como fazer isso serão shiong, um pós-doutorado no laboratório, Kaleena Melek, uma estudante de pós-graduação no laboratório, e Arian Perez Garcia, um pós-doutorado no laboratório. A principal vantagem dessa técnica sobre o método existente, como camundongos transgênicos, é que ela consome muito menos tempo.

Este método pode ajudar a responder a questões imunológicas importantes, como qual TCR pode dar melhor resposta contra antígenos. Esta técnica pode ser aplicada para terapia de transferência de células T adotiva, que tem se mostrado promissora para o tratamento de pacientes com câncer e consiste na modificação in vitro de células T humanas Para garantir a expressão igual das cadeias alfa e beta do receptor de células T. Subclonar o gene de interesse no mesmo vetor retroviral sob controle do mesmo promotor.

Prepare DNA de plasma de alta qualidade usando o kit de preparação Kyogen Maxi e faça um estoque de um micrograma por microlitro. Remova o meio da placa com células de embalagem retroviral de platina E e lave a placa uma vez com um XPBS. Desalojar as células adicionando tripsina EDTA e incubar a 37 graus Celsius por alguns minutos.

Neutralize as células desalojadas com meio DMEM e transfira para um tubo de falcão. Em seguida, centrifugue as células a 1000 vezes G por cinco minutos. Aspirar o supinato e ressuspender o sedimento celular em meio DMEM.

Determine o número de células e dilua as células em 0,6 vezes 10 elevado a seis por mililitro. 10 mililitros de suspensão celular em uma placa de cultura de tecidos revestida com polilisina de 10 milímetros e cresça durante a noite em uma incubadora de células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, examine as células ao microscópio óptico para verificar aproximadamente 80% de fluência de CO.

Remova cuidadosamente a mídia da placa. Lave as células uma vez com um XPBS e adicione 10 mililitros de meio DMEM fresco pré-aquecido sem penicilina ou estreptomicina. Para o complexo de transfecção média labial, prepare duas misturas e opti ME M1 de DNA e a outra de equilíbrio do reagente de lipectomia separadamente por cinco minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, misture delicadamente e incube por 20 minutos. À temperatura ambiente, pingue lentamente a mistura nas células E de platina. Balance suavemente a placa para frente e para trás para distribuir a mistura de transfecção uniformemente.

Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora de células. Após seis a oito horas, substitua o meio por 10 mililitros de meio DMEM fresco para a produção viral. Colha um baço de camundongo e transfira para o meio RPMI.

Coloque o baço em um filtro de células. Amasse o baço com um êmbolo de seringa em uma placa de cultura de tecidos de cinco centímetros. Enxágue as células do filtro de células com PBS estéril para colher as células centrifugue a 1000 vezes G por cinco minutos.

Descarte o alimentador. Continue suspendendo o pellet celular em um tampão de lise CK. Adicionando dois mililitros por baço, incube por dois minutos.

À temperatura ambiente. Adicione o meio RPMI até 20 mililitros e centrifugue a 1000 vezes G por cinco minutos. Finalmente, ressuspenda o pellet celular em PBS estéril.

Determine o número de células e centrifugue a 1000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. A fim de ativar as células T de camundongo antes da transdução viral placas de revestimento com anticorpos ativadores, ou seja, anti CD três épsilon e anti CD 28. Prepare uma mistura de anticorpos de um micrograma por mililitro de anti CD, três épsilon e dois microgramas por mililitro de anti CD 28 em PBS estéril, dispense 250 microlitros da mistura de anticorpos em cada poço da placa de cultura de tecidos de 24 poços e incube por duas horas a 37 graus Celsius.

Rotule magneticamente as células do baço de acordo com o manual do produto. Coloque uma coluna LS no campo magnético. Aplique a suspensão de célula rotulada na coluna.

Colete o fluxo através de células T enriquecidas de CD oito mais células T. Lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão e combinado com o sopro anterior. Cose as células com anticorpos anti CD três épsilon e anti CD oito alfa e citometria de fluxo analisada.

Em seguida, centrifugue as células a 1000 vezes G por cinco minutos e ressuspenda a célula a 1 milhão de células por mililitro em meio RPMI com IL humano recombinante dois. Remova a solução de anticorpos da placa de ativação. Enxágue cada bem com PBS estéril.

Adicione um mililitro da suspensão celular a cada poço e coloque a placa a 37 graus Celsius. 5% de dióxido de carbono em uma incubadora de células. Após dois dias de produção do vírus, o meio na placa de células ESE de platina deve ficar amarelo.

Transfira o supinato viral para um tubo cônico de 15 mililitros para remover os detritos celulares. Centrifugar o sobrenadante do vírus S a 1000 vezes G durante cinco minutos. Transfira cuidadosamente o vírus supinato para um novo tubo.

Deixe um pouco de líquido no fundo do tubo e não perturbe os detritos das células. Colete as células T ativadas da placa em um tubo cônico de 50 milímetros. Determine o número da célula.

Guarde algumas células em um tubo separado para ser usado como centrífuga de controle negativo a 1000 vezes G por cinco minutos e descarte o nadante supino. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em decúbito dorsal do vírus. Natante a 10 elevado a seis células por mililitro com 20 nanogramas por mililitro de humano recombinante, interleucina dois e 10 microgramas por mililitro de sulfato de proteína.

Adicione um mililitro de suspensão celular a cada poço da placa de 24 poços para o tubo de controle. Resus. Suspenda as células em meio RPMI na mesma densidade celular com a mesma quantidade de humano recombinante, interleucina dois e sulfato de proteína. Adicione as células à mesma placa.

Enrole a placa com centrífuga de filme plástico por 90 minutos a 2000 vezes G a 32 graus Celsius sem quebra. Após a centrifugação, remova o filme plástico. Adicione um mililitro de meio RPMI fresco com 20 nanogramas por mililitro de interleucina humana recombinante dois a cada, coloque a placa de volta na incubadora.

É importante examinar as células T transduzidas diariamente. Divida as células em uma a três proporções quando necessário. Não deixe as células crescerem demais ou deixe o meio ficar amarelo no sexto ou sétimo dia.

Corar as células com anticorpo e tetrâmero MHC específico para o TCR para avaliar a expressão de TCR na superfície das células T. Use as células T UNSD como controle. Essas células T transduzidas estão agora prontas para outras aplicações a jusante.

Antes da transdução viral. É vantajoso obter subconjuntos de células T de alta pureza usando esferas magnéticas comerciais para avaliar o nível de expressão de TCRs em células T. Podem ser utilizados anticorpos específicos para cadeias TCR alfa ou beta.

Normalmente, 30% a 80% das células podem expressar TCR transduzido, dependendo dos genes TCR e dos títulos de vírus. O tetrâmero MHC específico para o TCR também pode ser usado para verificar ainda mais a expressão funcional dos TCRs. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as células em condições saudáveis após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de liberação de ácido de citotoxicidade ou citocinas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a especificidade e a sensibilidade da transdução. Os TCRs.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ser um especialista em transduzir seu TCR favorito em células T primárias. Então, vejo você no laboratório.