Expansão ex vivo de células tumorais T-reativa por Meios de 1/Ionomycin Bryostatin eo Common Gamma Cadeia Formulação Citocinas

Os objetivos deste experimento são induzir a ativação de células T pela micina de um íon da estatina Brios, bem como a diferenciação de células T por citocinas de cadeia gama começa com o isolamento de células T sensibilizadas por tumor do baço e linfonodos. Em seguida, ative com brios estatina um e íon micina dois miméticos de sinal intracelular que aumentam a atividade da proteína quinase C e o cálcio intracelular, respectivamente. Cultura na presença de IL sete IL 15 e IL dois para a diferenciação e expansão de células T reativas tumorais.

A poderosa combinação de resultados do interferon gama EISA e o ensaio de citotoxicidade de fato podem lançar luz sobre a reatividade tumoral das células T expandidas e oferecer insights potenciais para a imunoterapia adotiva. Este método de expansão exvivo de células T reativas ao tumor pode ajudar a responder a questões-chave em questões de imunologia tumoral, como qual é o papel das citocinas comuns de imagem gama na diferenciação de células T reativas ao tumor. E qual é o papel de cada fenótipo de célula T, como células efetoras, células de memória efetoras e células de memória central na geração de resposta de memória de longo prazo contra o câncer.

O isolamento dos gânglios linfáticos e do baço e o manuseio séptico dos linfócitos são procedimentos difíceis de implementar, mas podem ser aprendidos rapidamente. Por observação. Os camundongos fêmeas transgênicos FVBN 2 0 2 expressam um novo transgene de rato inativado sob a regulação do promotor MMTV e, como resultado, desenvolveram carcinoma mamário espontâneo entre quatro e 10 meses de idade.

Neste protocolo, esses camundongos portadores de tumor espontâneo são usados como doadores de células T reativas ao tumor. Para começar, isole os linfonodos e baços de drenagem do tumor de camundongos transgênicos FVBN 2 0 2. Agora prepare uma suspensão de célula única em RPMI 1640 gelado suplementado com 10% FB sce A cultura de 10 a seis células por mililitro em meio completo contendo 15% FBS com um micromolar cin cinco nano molar brios estatina um e 80 unidades por mililitro.

IL dois por 16 horas com nosso meio PMI equilibrado a 37 graus Celsius, lave as células três vezes, depois cultive de 10 a seis células por mililitro em meio completo com 10 nanogramas por mililitro, cada um de IL sete e IL 15 por 24 horas. Para ativar ainda mais as células, pulse com uma adição de 40 unidades por mililitro IL dois por 24 horas. Agora divida as células e cultive-as com 10 nanogramas por mililitro, cada um de IL sete e IL 15 por mais quatro dias, se necessário, troque o meio e divida as células a cada dois dias.

Colha as células T primárias expandidas por centrifugação, enumere as células por microscopia de luz e calcule a expansão da dobra das células T. Agora prepare as células para citometria de fluxo para determinar a proporção de células T CD oito positivas e CD quatro positivas. Primeiro, bloqueie a ligação não específica de anticorpos aos receptores FC incubando as células com anticorpo anti CD 16, CD 32 por 20 minutos no gelo.

Em seguida, lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS gelado suplementado com 1% de azida de sódio, core as células incubando com anticorpos Fitz CD quatro e PE CD oito por 20 minutos no gelo. Lave duas vezes com dois mililitros de PBS gelado suplementado com 1% de FBS e 0,1% de azida de sódio. Finalmente, fixe as células com aldeído paraforme 1% e analise as amostras em um Beckman Coulter FC 500 usando o software summit versão 4.3 em seis placas de cultura de poço, pipeta células T com células tumorais mamárias em uma proporção de 10 para um efetor para alvo e três mililitros por poço.

Meio completo contendo 20 unidades por mililitro de IL dois incubam a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Realize a coloração de anticorpos de três cores para novos, seguidos de PE anti-US IgG e Xin five fite e iodeto de propídio de acordo com os fatos do protocolo do fabricante em novas células tumorais positivas e analise a viabilidade das células tumorais com um Xin five pi. Uma ativação de células T com BI por 16 horas resulta na morte de células T virgens que não são sensibilizadas com o tumor in vivo.

Após a bi seletividade das células T reativas ao tumor, elas se expandem até 2,8 vezes em uma cultura de seis dias com as citocinas da cadeia gama, tanto as células T CD oito positivas quanto as quatro positivas são igualmente expandidas com as citocinas da cadeia gama. Após uma cultura ex vivo de seis dias, as células T expandidas ex vivo apresentam alta responsividade contra os tumores aos quais os camundongos doadores foram sensibilizados, conforme avaliado pela produção de interferon gama. Na presença de novas células tumorais positivas de carcinoma mamário de camundongo ou MMC, as células T expandidas ex vivo podem induzir apoptose nas novas células tumorais MMC positivas, de modo que a viabilidade das células tumorais cai de 92% para 61% em 48 horas.

Ao tentar este procedimento, lembre-se de trabalhar em condições assépticas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como selecionar e expandir células T ativas do tumor para terapia adaptativa de células T de cânceres.