Preparação de Ésteres Metílicos de Ácidos Graxos (FAMEs) a partir de Biomassa Bacteriana

As bactérias regulam a fluidez da membrana usando lipídios da membrana, como ácidos graxos.

Para analisar a composição de ácidos graxos, espalhe um inóculo bacteriano em uma placa de ágar rica em nutrientes e incube até formar um gramado.

Raspe o gramado, transfira a biomassa para um tubo e feche-o.

Em seguida, adicione uma solução alcalina metanólica, vórtice para dispersar as células e incubar.

A solução alcalina decompõe os lipídios da membrana, liberando ácidos graxos e convertendo-os em ésteres metílicos de ácidos graxos não polares, ou FAMEs.

Adicione ácido acético para neutralizar o pH, o que estabiliza os FAMEs.

Introduzir um solvente orgânico não polar e um vórtice.

O solvente dissolve os FAMEs, que se acumulam na fase superior, separando-os da camada aquosa e dos detritos celulares.

Transfira a fase superior para um tubo limpo.

Aplique um jato de nitrogênio para evaporar o solvente. Isso concentra os FAMEs enquanto evita a oxidação.

Os FAMEs estão prontos para análise.

Para iniciar este procedimento, prepare um gramado da bactéria espalhando 100 microlitros de uma cultura noturna da cepa, incubada a 30 graus Celsius em LB, sobre a superfície da placa de meio de ágar LB. Incube a placa durante a noite a 30 graus Celsius.

Para obter ácidos graxos lipídicos, colha as células bacterianas raspando as colônias da placa de ágar e transferindo aproximadamente 40 miligramas para um tubo de vidro de dez mililitros com tampa de rosca e vedação de PTFE. Para realizar a transesterificação, adicione cinco mililitros de hidróxido de potássio 0,2 molar em metanol às células bacterianas frescas. Vórtice e incubar a 37 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, adicione um mililitro de ácido acético molar para diminuir o pH para sete. Agora, adicione três mililitros de hexano e vórtice em um minuto para extrair os ésteres metílicos de ácidos graxos ou FAMEs. Transferir a fase superior para tubos limpos e concentrar por evaporação à temperatura ambiente sob um fluxo contínuo de nitrogênio para obter aproximadamente 200 microlitros de extrato de FAME.