Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar células-tronco epiteliais adultas da pele humana. Isso é feito primeiro cortando a pele humana fresca do lifting facial ou outra cirurgia em tiras de um centímetro de largura e incubando em meios contendo espaço em disco. A pele é então enxaguada em meio fresco e os folículos pilosos são arrancados.

Em seguida, os folículos são separados em folículos telógenos e antígenos, examinando-os sob um microscópio de dissecação, a etapa final do procedimento é os folículos de tripsina em suspensão de célula única e plaqueamento em placas de cultura. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o crescimento de células gênicas do clone por meio de contraste de fase. Microscopia A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de corte, depenagem e identificação são difíceis de aprender porque poucas pessoas estão familiarizadas com a dissecção microscópica assistida de folículos cutâneos e pilosos.

Para iniciar a extração de células-tronco epiteliais da pele humana, corte a pele fresca do couro cabeludo humano em tiras de um centímetro de largura, cortadas paralelamente ao crescimento do cabelo, para não cortar os folículos. Adicione a pele a um tubo cônico com DMEM contendo 10% de FBS e quatro miligramas por mililitro. Base do disco.

Incubar a amostra por duas a quatro horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, enxágue a pele com DMEM fresco contendo 10% de FBS e coloque em uma placa de Petri estéril. Colete os folículos puxando suavemente cada cabelo com firmeza e suavidade da base com uma pinça.

Coloque os folículos pilosos isolados em meios frescos. Em seguida, use um microscópio de dissecação para selecionar folículos no estágio telógeno. Com base em sua morfologia, corte a região da protuberância e transfira os folículos para um tubo esterilizado de 15 mililitros.

Além disso, folículos de antígeno podem ser usados. Corte o terço superior dos folículos para obter a região de protuberância do folículo piloso das células-tronco ou corte a ponte do bulbo em células amplificadoras de trânsito de matriz isolada e adicione ao tubo de coleta. Em seguida, adicione quatro mililitros de uma solução um-para-um de 0,05% de tripsina EDTA e 0,53 milimolar de EDTA tetra sódico por 15 a 20 minutos.

À temperatura ambiente, agite o tubo periodicamente para misturar as células destacadas que podem ser visualizadas sob um escopo de dissecação. Para monitorar o progresso da digestão. Para interromper a digestão, adicione quatro mililitros de DMEM mais FPS e centrifugue por cinco minutos.

A 800 RPM, descarte o supernat com cuidado, economizando aproximadamente 0,2 a 0,5 mililitros para evitar a perda de células e ressuspenda em um mililitro de meio queratinócito sem EGF. Antes de plaquear as células-tronco epiteliais para cultura A seis placas de mitomicina C tratadas com três T três J duas células alimentadoras devem ser preparadas de acordo com o protocolo escrito. Em seguida, veja as células-tronco isoladas do folículo piloso incubarem as células durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono no dia seguinte.

O meio mudou para meio de queratinócitos com fator de crescimento epidérmico e retorna à incubadora. Alimente as células a cada dois dias com meio de queratinócitos mais EGF e cultive-as por 14 a 20 dias. Para passar as células-tronco, as células alimentadoras devem ser removidas.

Primeiro, lave as células uma vez com PBS e adicione temperatura ambiente suficiente, 0,53 milimolar tetra sódio EDTA para cobrir as células. Incube as células em temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, agite suavemente o prato e as três células T três J e duas células alimentadoras se soltarão, aspire as células alimentadoras.

Lave a placa de células-tronco com PBS uma vez e adicione pré-aquecimento suficiente a 37 graus Celsius, duas x viagens em EDTA para cada poço para cobrir. As células incubam a 37 graus Celsius por sete a 15 minutos para permitir que as células-tronco do folículo piloso se desprendam completamente. Depois que as células se desprenderem, adicione aproximadamente 500 microlitros de meio de queratinócitos sem EGF para parar a tripsina e pipete suavemente para cima e para baixo para dispersar as células.

Recolher as células num tubo cónico e centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Aspirar o supernat e ressuspender as células em meio de queratinócitos sem EGF. Finalmente, conte e reflate as células em uma mitomicina C tratada com três T três J duas camadas de células.

Para imortalizar as células-tronco, coloque 350.000 células-tronco por poço de uma placa de seis poços em uma camada de mitomicina C tratada com três células T três J e duas células alimentadoras. Cultive as células por dois dias no segundo dia, trate PA três 17 LX SN 16 E seis E sete células, que codificam HPV 16, E seis e E sete com mitomicina C por duas horas, conforme descrito no protocolo escrito. Após a incubação, adicionar as células tratadas às células-tronco epiteliais primárias, deixando um poço de células-tronco sem tratamento como co-cultura de controle de seleção por seis dias em meio de queratinócitos com EGF, trocando o meio a cada dois dias após seis dias, remover o alimentador e PA três células 17 tratando com 0,53 milimolar tetra sódio e dta.

Como antes, adicione 200.000 mitomicina C tratada com três células T três J e duas NHP por poço. As três células T três J e duas NHP são células alimentadoras resistentes à neomicina, higromicina e pur micina, o que é necessário para o procedimento de seleção. Para cultura de seleção, as células abaixo de 0,2 miligramas por mililitro de medicamento ou G quatro 18 por mais seis dias.

Renove G quatro 18 fresco contendo meio de QUERATINÓCITOS mais EGF a cada dois dias. As células-tronco epiteliais sobreviventes serão células-tronco imortalizadas nesta imagem de campo claro. As células-tronco epiteliais da pele formam colônias epiteliais apertadas designadas pelo E quando cultivadas em meio de queratinócitos com uma camada alimentadora de células designadas pelo F mostrado aqui são implantes de folículos pilosos que dão origem a conseqüências epiteliais.

A região do bojo telógeno designada pelo T é anexada ao prato e cercada pela colônia de células epiteliais junto com as células alimentadoras. As colônias de células-tronco em cultura mantêm a expressão de marcadores epiteliais, como a citoqueratina 15 mostrada aqui em verde, e mantêm a pluripotência quando diferenciadas ao longo da linhagem do folículo piloso. As células-tronco epiteliais da pele expressam K six hf, um marcador do folículo piloso.

Além disso, as células podem ser cultivadas na epiderme, derme ou outras matrizes na interface ar-líquido e formarão uma epiderme estratificada com uma camada cornificada, camada granular e camada espinhosa. E, finalmente, glóbulos positivos vermelhos de óleo podem ser vistos a partir de células-tronco induzidas ao longo da linhagem sebácea. Após este procedimento, ensaios de células-tronco para proliferação auto-renovada, migração celular, adesão e diferenciação podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre genes envolvidos na manutenção do fenótipo de células-tronco.