Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

Em células de mamíferos, o retículo endoplasmático ou ER desempenha um papel importante na biogênese de proteínas e na sinalização de cálcio. O complexo sexual heterotrimérico 61 na membrana do ER fornece um caminho aquoso para polipeptídeos recém-sintetizados no lúmen do ER. Dados recentes sugerem que o sexo 61 também pode formar canais transitórios de vazamento de cálcio para abordar diretamente o papel do complexo Sex 61 como um potencial canal de vazamento de cálcio.

E para caracterizar seus supostos mecanismos regulatórios, as células são primeiro tratadas com siRNAs direcionados contra o gene sexual 61 A um. Na análise de complementação, as células são transfectadas com um vetor GFP da íris que permite a expressão resistente à irna do gene sex 61 A one do tipo selvagem. Em seguida, as células são carregadas com o indicador métrico de cálcio RO dois e as alterações na concentração de cálcio citosólico são monitoradas por microscopia de fluorescência.

À medida que os níveis de cálcio são medidos, são realizadas trocas de solução para avaliar o impacto de vários agentes, como antagonistas da calmodulina e argônio fabs, no vazamento de cálcio. A análise quantitativa das imagens resultantes revela alterações no fluxo de cálcio F induzidas pelo silenciamento do sexo 61 A. Neste vídeo, um modelo para o papel do sexo 61 A no fluxo de cálcio F será apresentado após a demonstração do procedimento e apresentação dos resultados.

A principal vantagem dessa técnica de métodos existentes, como experimentos biológicos de lipídios planetários ou medições de canal único, é que as proteínas de membrana candidatas podem ser analisadas no ambiente nativo e sem purificação tediosa e reconstituição funcional tipicamente ineficiente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da sinalização de cálcio, como, por exemplo, qual é a contribuição de proteínas de membrana específicas do ER para o ffl de cálcio do ER em diferentes tipos de células e como elas são controladas? Demonstrar o procedimento será longo e NICO dois talentosos alunos de pós-graduação de nossos laboratórios Comece este procedimento preparando as soluções e reagentes a serem usados Primeiro, prepare o tampão livre de cálcio de acordo com as instruções do protocolo escrito que o acompanha.

Ligue em seguida, dilua uma solução estoque do indicador de cálcio. Die fira 2:00 AM em um mililitro de DMEM contendo 10% FBS e 1% de estreptomicina de penicilina para uma concentração final de quatro micromolares diluir uma solução de estoque de Apso Garin de um milimolar em tampão livre de cálcio para uma concentração final de três micromolares também tem em mãos 200 oleína A micromolar e 20 micromolar para reduzir o risco de estudar os efeitos fora do alvo de um irna específico. Dois irna diferentes são usados para silenciar cada gene para avaliar possíveis efeitos colaterais do procedimento de transfecção.

Os siRNAs de controle negativo, que são compostos por uma sequência aleatória de nucleotídeos, são transfectados em paralelo com os siRNAs experimentais. É importante que o efeito do silenciamento mediado por irna possa ser resgatado pela expressão de CD NA do tipo selvagem. Portanto, os siRNAs usados para o experimento são especificamente selecionados para que o plasmídeo de resgate não seja afetado pelos siRNAs. Neste experimento, os siRNAs são direcionados contra a região de revestimento e não revestimento ou região não traduzida, abreviada UTR do gene de interesse.

Quando os siRNAs são direcionados contra o resgate de UTR, plasmídeos sem o UTR endógeno podem ser usados para realizar transfecção em células hela. Prepare as células para a transfecção colocando uma lamínula revestida de poliol lisina de 25 milímetros em uma placa de cultura de células de seis centímetros para cada transfecção após uma hora, adicione 5,2 vezes 10 às quintas células hela e suplementado com DMEM a cada placa. Para transfectar as células, rotule um tubo de microcentrífuga.

Para cada reação de transfecção a cada tubo, adicione quatro microlitros de 20 microlitros de S irna micromolar dissolvido em 80 microlitros de ótimo aqui, SEC 61 A um, sexo 61 A um UTR e irna de controle negativo são preparados para cada tubo. Adicione 20 microlitros de reagente de transfecção hiper perfeito suavemente em vórtice e, em seguida, incube as reações em temperatura ambiente por 10 minutos. Para transfectar as células, adicione a mistura de irna 104 microlitros no total gota a gota às células heli assentadas e gire suavemente o prato para garantir uma distribuição uniforme dos complexos de transfecção.

Incubado a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, substitua o meio por 3,9 mililitros de meio fresco. Em seguida, para aumentar a eficiência da transfecção, execute a transfecção uma segunda vez, usando a mesma mistura de irna para avaliar o silenciamento, realize a análise de western blot.

O silenciamento deve estar acima de 80%, como mostrado aqui para o sexo 61 A. O efeito silenciador máximo é tipicamente visto 96 horas após a primeira transfecção, 48 horas após a primeira transfecção preparada para resgatar o fenótipo resultante do sexo. 61 Silenciamento Comece rotulando um novo tubo de microcentrífuga.

Para cada reação, as células agora serão transfectadas com vetor vazio ou sexo selvagem. 61 Um plasmídeo de uma expressão. O plasmídeo de expressão de tipo selvagem usado aqui foi gerado pela inserção de um cDNA de sexo 61 A no sítio de clonagem múltipla de um pcd.

Um vetor GFP de três entradas ribossômicas internas contendo o promotor do citomegalovírus, a íris mais a sequência de revestimento de proteína fluorescente verde. Prepare o reagente de transfecção adicionando quatro microgramas de cada plasmídeo dissolvido em 80 microlitros de optimum a cada tubo. Em seguida, adicione 16 microlitros de reagente de transfecção HD do gene FU suavemente vórtice esta solução e incubada em temperatura ambiente por 10 minutos.

Em seguida, depois de trocar o meio, adicione a mistura de plasmídeo gota a gota às 5,2 vezes 10 assentadas às quintas células heli e gire suavemente o prato para garantir uma distribuição uniforme dos complexos de transfecção. Coloque as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube por mais 48 horas. Para determinar a eficiência da transfecção, avalie a expressão de GFP por microscopia de fluorescência.

Após 48 horas, pelo menos 80% das células devem ser transfectadas. Antes da imagem. Use uma pinça para transferir as lamínulas com as células hela transfectadas para uma nova placa de cultura de células de 3,5 centímetros e adicione um mililitro de DMEM com quatro micromolares.

Se você estiver às 2:00 da manhã, incube por 45 minutos a 25 graus Celsius no escuro. Para realizar a geração de imagens, transfira a lamínula com as duas células carregadas para uma câmara de gravação de metal e fixe-a no lugar aparafusando as duas partes da câmara. Usando uma pipeta, adicione e remova 300 microlitros de tampão livre de cálcio nas células para lavá-las.

Repita e monte a câmara de gravação em um microscópio I MIC com cinco cremadores policromados. Usando um conjunto de filtros para URA dois, encontre um campo contendo pelo menos 20 células para estimar a fluorescência independente de cálcio de FU A dois. O comprimento de onda de excitação usado nesta etapa é de 360 nanômetros.

Uma vez que um campo adequado é selecionado, configure o software de imagem para excitar em 340 nanômetros e 380 nanômetros e para medir a fluorescência emitida em 510 nanômetros a cada três segundos, defina o tempo de exposição para produzir intensidades de fluorescência em torno de 1000 unidades arbitrárias para a configuração mostrada aqui. Um tempo de exposição de cinco milissegundos é definido. Além disso, marque as regiões de interesse ou ROIs para uma região de fundo livre de células e até 20 contornos de células.

Inicie a imagem de células de vida enquanto o experimento está em execução, o sistema apresentará as imagens métricas de proporção para menos dois sinais, bem como as razões F três 40 F três 80 em tempo real para cada ROI marcado como um gráfico de linhas onde F três 40 e F três 80 correspondem à intensidade de fluorescência dentro das ROIs em 340 e 380 nanômetros, respectivamente. Após um minuto, adicione soluções de teste à câmara de imagem para testar diferentes parâmetros experimentais. Nesses experimentos, o antagonista de Cal Modlin, o triflúor e a bollina A são testados após a realização de medições métricas de proporção por mais 10 minutos.

Para antagonistas modulares CAL, adicione DSA gargan e continue as medições. Grave 400 imagens emparelhadas por experimento. Depois que as imagens forem coletadas, revise as imagens e marque as ROIs para pelo menos 20 células para cada campo de visão.

Em seguida, use a opção de análise cinética no software para criar uma sequência de imagens de razão subtraída de fundo e um gráfico mostrando a cinética da razão de cálcio subtraída de fundo. Para cada ROI, por fim, exporte os dados para excel e origem usando um método de calibração estabelecido. A concentração de cálcio no citosol pode ser calculada a partir de medições de proporção para examinar se o gene do sexo 61 A afeta o vazamento de cálcio do er.

O gene sexual 61 A foi silenciado por dois RNAs diferentes e células helo por 96 horas. O silenciamento foi avaliado pela análise de sangue ocidental de números de células semelhantes em triplicata, como mostrado aqui, há um forte sinal alfa 6 61 nas pistas um a três e um sinal significativamente mais fraco nas pistas quatro a seis e sete a nove que correspondem às células 6 61 A um silêncio. Para quantificar os resultados, os sinais alfa do sexo 61 foram normalizados para sinais de beta actina maiores que 80% de silenciamento foi alcançado para testar o papel da calmodulina no fluxo F de cálcio do RE.

URA duas imagens do sexo 61 A um senhor A tratado com células helio foi realizado na presença ou ausência do antagonista de Cal Modin. Bollin A.Este filme mostra células de controle tratadas com bollin 10 minutos após bollin. A liberação de cálcio do tratamento foi iniciada com a aplicação de FSO Gargan, um inibidor de circa que desmascarou a liberação de cálcio do RE na ausência de cálcio externo, como pode ser visto aqui.

A adição de argônio FSA levou a um aumento transitório, mas significativo, na fluorescência, indicando o fluxo de cálcio F do er. Em contraste, o fluxo de cálcio F após a adição de FSO garina no osso PHE, um sexo tratado com 61 A células silenciosas é muito menos pronunciado, como pode ser visto aqui. Essa diferença pode ser vista claramente neste diagrama, que mostra o cálcio estimado do citosol ao longo do tempo em uma série de filmes, os resultados quantitativos mostrados aqui confirmam o aumento do cálcio flx nas células de controle em resposta ao argônio na presença de offi bolin A, como pode ser visto neste diagrama de barras.

O mesmo fenômeno foi observado para um segundo antagonista do came, a triazina. No entanto, os efeitos dos antagonistas cam não foram observados quando o complexo sexual 61 foi esgotado das células por qualquer um dos dois sexos. 61 A um siRNAs específicos resgate parcial deste fenótipo pode ser visto quando sexo 61 A uma células silenciosas foram transfectadas com sexo.

61 um plasmídeo de uma expressão, como pode ser visto aqui. O ffl de cálcio em resposta aos agonistas de Cal Modin é parcialmente restaurado com a transfecção do plasmídeo do tipo selvagem insensível à irna. Esses resultados sugerem que Cal Modlin está envolvido na limitação do flx de cálcio ER no nível de um complexo sexual 61 nas células.

Nesse caso, a transfecção de sexo, 61 A um gene com uma mutação dupla no local de ligação de Cal Modin não deve resgatar o fenótipo induzido por irna. De fato, quando as células foram transfectadas usando um plasmídeo de expressão sexual 61 A com uma dupla mutação no motivo de QI, não houve resgate do fenótipo em conjunto. Esses dados indicam que a liberação de cadeias nascentes do complexo sex 61 de fato leva à liberação de cálcio do ER e à formação de um nanodomínio de cálcio ao redor da boca cyto select do complexo sex 61.

Este cálcio é ligado por Cal Moulin e cálcio Cal Moulin fecha o complexo sexual 61. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como combinar o silenciamento de genes mediado por IRNA em células humanas com imagens de cálcio de estilo de vida após este procedimento. Outros métodos, como a expressão de CDNAs com mutações de ligação de doenças, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o impacto potencial de mutações de ligação de doenças em componentes irrelevantes.

E não se esqueça que trabalhar com medicamentos como o tap, novamente, pode ser extremamente perigoso e a precursão, como o uso de luvas, deve sempre ser tomada durante a realização deste procedimento.