Name: Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Aprenda a combinar silenciamento gênico por siRNA com imagens de cálcio em células vivas para estudar canais de vazamento de Ca²⁺ no retículo endoplasmático. Este método revela mecanismos regulatórios em sinalização celular.

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SL foi apoiado por uma bolsa da DFG (Graduate School Research 845). Este trabalho foi financiado por concessões do DFG (SFB 530/C1 &amp; PARA 967) e por HOMFOR.

1. Preparação das soluções de reserva <ol><li> Prepare-cálcio livre de buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM EGTA, 10 mM de glicose em 10 mM HEPES-KOH (pH 7,35)). </li><li> FURA-solubilizar 02:00 em DMSO para obter uma solução estoque 1 mM. Misture usando um vortex até que a solução é amarelo claro de forma homogênea. Proteger copo da luz. Diluir o FURA-2:00 solução estoque em 1 ml Dulbecco modificado da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina para uma concentração final de 4 mM para o carregamento de células HeLa. </li><li> Prepare uma solução estoque 12,5 mM puromicina em água destilada (pH 7,0). Alíquotas armazenar a -20 ° C. Diluir a solução estoque 12,5 mM puromicina no buffer livre de cálcio para uma concentração final de 500 mM puromicina. </li><li> Dissolver tapsigargina em DMSO para obter uma solução a 1 mM de stock. </li><li> Solubilizar 1 mg ophiobolin A em 20 mL de clorofórmio e, em seguida, misturar com 25 mL de DMSO. O tubo de microcentrífuga permanece aberta até o clorofórmio é evaporado. Assim, o ophiobolin final A concentração é 100 mm. Alíquotas armazenar a -20 ° C. Antes do uso, diluir as soluções estoque em cálcio livre de buffer para uma concentração final de 100 mM. Assim, a concentração de DMSO final para imagens de células vivas não exceda 0,1%. </li><li> Dissolver trifluoperazina em DMSO a uma concentração de 10 mM e alíquotas armazenar a -20 ° C. Soluções diluídas em estoque de cálcio livre de buffer para uma concentração final de 10 mM antes do uso. Assim, a concentração final para DMSO imagens de células vivas, como por ophiobolin A, não exceda 0,1%. </li><li> Dissolver os siRNAs (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR e siRNA siRNA de controle) em água livre de RNase para preparar uma solução estoque 20 mM. Misture usando um vortex e observar solubilização a olho nu. Armazenar 50 mL alíquotas a -20 ° C. </li></ol> 2. Silenciamento de genes em células HeLa , A fim de estudar a contribuição de uma determinada proteína para ER Ca 2 + de efluxo, o respectivo gene tem que ser eficiente silenciada com duas diferentes siRNAs (Fig. 1). Além disso, o efeito do silenciamento tem de ser superado pela expressão do gene respectivo tipo selvagem. Normalmente usamos siRNAs que são dirigidos contra a codificação e não-codificantes região (UTR), respectivamente, do gene de interesse. Empregando UTR-dirigido siRNA fornece uma maneira conveniente para complementação. <ol><li> Sementes 5,2 x 10 5 células HeLa (ATCC n º. CCL-2) em uma placa de cultura 6 centímetros com uma lamínula de 25 mm (pré-tratados com 200 mL de poli-L-lisina (1 mg / ml) por 1 h) em Dulbecco modificado da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina e incubar a 37 ° C em um ambiente umidificado com 5% de CO 2 (volume final 3,9 ml). </li><li> Transfecção as células com SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA, ou uma siRNA controle negativo usando reagente HiPerFect acordo com as instruções do fabricante (concentração final de siRNA: 20 nM). Brevemente, prepare siRNAs recentemente em um tubo de microcentrífuga separado antes do procedimento de transfecção real: Adicionar 20 mL de reagente de transfecção HiPerFect a 4 mL de cada siRNA (20 mM) que é dissolvido em 80 mL de OptiMEM. Esta mistura é gentilmente agitadas e incubadas em temperatura ambiente por 10 min. Adicione a mistura de siRNA (104 mL) gota a gota a 5,2 semeado x 10 5 células HeLa (3,9 ml). </li><li> Após 24 h, alterar o meio (3,9 ml) e transfecção as células pela segunda vez com a mistura siRNA mesma (104 mL). </li><li> Avaliar o silenciamento por Western blot. Deve ser acima de 80%. Lave as células da placa de cultura de células em tampão fosfato (PBS) e colhê-las em DMEM. Contar as células, empregando a Condessa contador de células automatizado. Lisar as células em tampão de lise celular (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40) suplementado com um coquetel de inibidores da protease (3 mg / ml Pepstatin A, 3 mg / Leupeptin ml, 3 mg / ml Antipaína, 3 mg / ml Chymastatin) e misture com amostra SDS-buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, 5% β-mercaptoetanol, 0,01% azul de bromofenol ) para obter uma concentração final de 10.000 células / ml. Amostras de calor a 56 ° C por 15 min e, posteriormente, adicionar algumas gotas glas e vortex por 20 min para o DNA do fragmento. 20 mL em separado de cada amostra por uma Laemmli do tipo SDS-PAGE (tipicamente 15% polyacrylamid para o gel de separação). Transferência de proteínas separadas em uma membrana de PVDF por eletrobloting ("wet-blot") em 400 mA constante por 3 horas ou durante a noite em tampão de transferência (100 mM glicina, 12,5 mM Tris-HCl). Depois, bloco com 5% (w / v) leite desnatado secas em PBS por 30 min em temperatura ambiente e, em seguida, expor o blot para o anticorpo primário dirigido contra o C-terminal de Sec61α de coelho e um anti-β-actina anticorpo de rato. Lave a mancha em 100-PBS-tritonX (0,05%) e tWICE em PBS por 5 min, respectivamente. Visualize os anticorpos primários utilizando ECL Plex-cabra anti-IgG de coelho-Cy5 ou ECL Plex-cabra anti-mouse IgG-Cy3-conjugado e do sistema de imagem Typhoon Trio em combinação com a imagem Quant TL software 7.0. No caso do gene SEC61A1, o efeito máximo silenciar é tipicamente visto 96 h após a transfecção em primeiro lugar. Um experimento representativo é mostrado na figura. 2. </li></ol> 3. Complementação das células HeLa A fim de resgatar o fenótipo de SEC61A1 silenciamento, o cDNA SEC61A1 foi inserido no sítio múltiplo de clonagem (MCS) de um local de entrada pcDNA3 interna ribossomal (IRES)-GFP vetor que continha o citomegalovírus (CMV), promotor do MCS, o IRES, além da proteína fluoresecent verde (GFP) seqüência de codificação. <ol><li> 48 h após a transfecção siRNA em primeiro lugar, troca o meio (3,9 ml) por uma segunda vez e transformar as células com um vetor vazio ou SEC61A1 expressão plasmídeo usando Fugene HD acordo com o protocolo do fabricante (razão final de vetor para Fugene HD é de 4 mg vector a 16 mL Fugene HD). Brevemente, prepare plasmídeos recentemente em um tubo de microcentrífuga separado antes do procedimento de transformação: Adicionar 16 mL de reagente Fugene transformação HD a 4 mg de cada plasmídeo que é dissolvido em 80 mL de OptiMEM. Delicadamente misturar este vortex e incubar em temperatura ambiente por 10 min. Adicione a mistura de plasmídeo (0,1 ml) gota a gota para o semeado 5,2 x 10 5 células HeLa (3,9 ml). </li><li> Após 48 h de expressão plasmídeo, placas de cultura sujeitos a microscopia de fluorescência antes da imagem de cálcio e colheita. Se necessário, substitua por DMEM PBS para melhor sinais de fluorescência. Gravar imagens de fluorescência em um microscópio de fluorescência equipado com câmera CCD refrigerado. Eficiência de transformação pode ser determinado pela divisão do número de células mostrando fluorescência da GFP por células contadas no modo claro e deve ser acima de 80%. Um resultado típico é mostrado na figura. 3. </li></ol> 4. Imagem de cálcio de células vivas <ol><li> Antes da medição, transfira o lamínula revestidas com células transfectadas HeLa em um prato separado cultura de 3,5 cm. Carregar as células com 4 mm de FURA-02:00 em 1 ml DMEM por 45 min a 25 ° C no escuro 11,12. </li><li> Fix a 25 milímetros lamínula na câmara de metal IMIC e lavar as células duas vezes e incubar em um tampão livre de cálcio (300 ml a cada vez). </li><li> Iniciar a coleta de dados em um microscópio com IMIC policromada V por alternadamente emocionante em 340 nm e 380 nm e medir a fluorescência emitida a 510 nm (set Filter: refletores, 565 nm; nm emissor, 605/70). Imagens de amostra contendo 20-50 células / s. quadro a cada 3 Registro FURA-2 sinais como o F340/F380 proporções, onde F340 e F380 correspondem à intensidade de fluorescência de fundo-subtraída a 340 e 380 nm, respectivamente. </li><li> Depois de 1 min, tratar células com puromicina (500 mM) em cálcio livre de buffer ou com o mesmo tampão. Alternativamente, tratar células com um inibidor da pequena molécula (como 10 ou 100 mM trifluoperazina mM ophibolin A) ou com o buffer de cálcio livre. </li><li> Após as medições raciométrica são realizadas por 2 ou 10 min, adicione tapsigargina (1 mM) e continuar as medições. </li><li> Eventualmente, cytoslic [Ca 2 +] é estimado a partir de avaliações da razão por um método de calibração estabelecidas. 2 Analisar dados pelo Excel 2007 e Origin 6.1. </li></ol> 5. Resultados representativos: Até agora, abordamos a questão de se silenciamento do gene afeta SEC61A1 cálcio (Ca 2 +) fugas do ER (Fig. 1). O gene foi silenciado SEC61A1 por dois siRNAs diferentes em células HeLa por 96 horas. Ao mesmo tempo silencia o crescimento celular duramente afetado e viabilidade, transporte de proteínas para o ER de semi-células permeabilizadas foi quase completamente inibida. Além disso, as células SEC61A1 silenciadas foram gravemente afectadas com relação a vazamento de Ca + 2 do ER. O efeito do silenciamento gênico foi revertida pela expressão do gene SEC61A1. Assim, Sec61 complexos que estão presentes na membrana ER de todas as células nucleadas forma Ca 2 + canais de vazamento que pode ser esperado para desempenhar um papel crucial na Ca 2 + homeostase. No entanto, a presença de grandes, cheios de água poros com permeabilidade de íons descontrolada, como formada por Sec61 complexos na membrana ER, seria interferir seriamente com o lançamento regulamentado de Ca 2 + do lúmen ER para o citosol, um mecanismo essencial para intracelular sinalização. Nós identificamos um motivo calmodulina (CaM) obrigatório em todos os citosólica N-terminal de Sec61α mamíferos que CaM ligado, mas não Ca 2 + livre apocalmodulin com afinidade nanomolar e especificidade de seqüência. A nível celular, dois antagonistas CaM diferentes estimulado Ca (Figs 4 e 5). Este último não foi observado quando Sec61 canais estavam presentes que continha mutações no motivo QI de Sec61α. Assim, Ca 2 +-CaM está envolvido na limitação Ca 2 + fugas do ER (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma. Ver texto para detalhes. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análise de dados para silenciar eficiência. Silenciamento foi avaliada por análise de Western-blot utilizando anticorpos que foram dirigidos contra Sec61α e β-actina (carga de controle). Os anticorpos primários foram visualizados por meio de anticorpos ECL Plex secundário e imagens de fluorescência. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análise de dados para a eficiência de transfecção. As imagens foram gravadas em um microscópio de fluorescência equipado com câmera CCD refrigerado. Eficiência de transformação pode ser determinado pela divisão do número de células mostrando fluorescência da GFP por células contadas no modo brightfield. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 tiros. Tela de imagens ao vivo de células de cálcio de células HeLa, na presença de controle ou SEC61A1 siRNA ea presença ou ausência do antagonista CaM-ophiobolin células A. HeLa foram tratados com siRNA contra SEC61A1 (B) ou um siRNA controle negativo (A) por 96 h, como indicado. Essas células foram carregadas com o indicador de cálcio FURA-2:00 e incubadas em Ca 2 + tampão contendo 0,5 mM livre EGTA, em seguida, buffer ou ophiobolin A (Ophio A) em tampão foi adicionado ea incubação retomada. Após 10 min, Ca 2 + release foi iniciada aplicando tapsigargina (TG) na ausência de Ca 2 + externo ea incubação continuou. Capturas de tela a partir da imagem de cálcio contínuas foram tomadas no tempo indicado. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Análise de dados para experimentos com imagens de células vivas de cálcio. (A) a análise cinética e quantitativa de uma série de experimentos, conforme ilustrado na figura. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] foi estimada a partir de avaliações da razão por um método de calibração estabelecidas de 2. O efeito da tapsigargina é mostrado como diagrama de barras. (BD), as células foram tratadas com siRNA controle ou indicado SEC61A1 siRNA para 48 horas e, em seguida, transformado com um vetor de controle (C), ou SEC61A1 expressão plasmídeo (C), ou expressão SEC61A1 mutante plasmídeo (D), como indicado. Após 48 h, experimentos com imagens de cálcio foram realizados como nas Figuras 4 e 5A. A análise estatística das mudanças na Ca 2 + citosólico concentração após a adição de tapsigargina em experimentos, tais como apresentados em A são mostrados. Valores P &lt;0,001 foram definidos como significativos pelo teste t não pareado e são indicados por três asteriscos (***), ns, não significativo. O número de células que foram analisados ​​são indicados. Valores médios são dados, barras de erro representam os erros padrão das médias (EPM). Notamos que esses exemplos foram adaptados de ref. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Estes dados indicam que a liberação de cadeias nascentes do complexo Sec61 fato leva à liberação de cálcio do ER e da formação de um nanodomain de cálcio ao redor da boca citosólica do complexo Sec61. Este cálcio está vinculado por calmodulina e cálcio-calmodulina fecha o complexo Sec61 ".

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+physiological+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li>
<li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li>
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<li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li>
<li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li>
<li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+signalling+by+Na%2B%2FCa2%2B+exchangers+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li>
<li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC5+is+a+Ca2%2B-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2%2B-selective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li>
<li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Em células de mamíferos, o retículo endoplasmático (ER) desempenha um papel fundamental na biogênese protéica, bem como na sinalização de cálcio. Aqui, descrevemos um sistema experimental que nos permite abordar diretamente o papel de um potencial de Ca + 2 canais de vazamento e para caracterizar a sua putativa mecanismos de regulação 13. Este sistema experimental nos dá a oportunidade única de i) avaliar a contribuição de diferentes proteínas da membrana para ER passiva Ca 2 + efluxo do ER em vários tipos celulares, ii) caracterizar as proteínas e os mecanismos que limitam esse passivo Ca 2 + de efluxo e iii) estudar os efeitos das mutações doença ligada nos componentes relevantes. Constatamos que apenas as células viáveis ​​devem ser analisados ​​e que a viabilidade global deve ser acima de 80%. Portanto, a viabilidade das células é rotineiramente avaliado empregando-ID Nuclear reagente viabilidade azul / verde celular acordo com o protocolo do fabricante. Além disso, a análise estatística das mudanças na Ca citosólico concentração 2 + é obrigatória. Portanto, os experimentos devem ser realizados para quatro lotes diferentes de células e duas lamelas com pelo menos 20 células devem ser analisados ​​para cada condição em um único experimento. Notamos que as diversas experiências devem ser realizadas ao mesmo tempo após a semeadura no lamínulas.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> DMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nuclear-ID azul / verde reagente viabilidade celular </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA-02:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Tapsigargina </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> A Ophiobolin </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazina </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Condessa ® contador de células automatizado </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Tufão Trio-sistema de imagem </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S microscópio com DS-5Mc câmera </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> microscópio IMIC com policromia V </td><td> Até Photonics </td><td></td></tr></tbody></table>

imagens ao vivo de cálcio celular combinado com sirna silenciamento gênico mediado identifica ca 2 + canais de vazamento na membrana er e seus mecanismos de regulação

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Em células de mamíferos, o retículo endoplasmático (ER) desempenha um papel fundamental na biogênese protéica, bem como em cálcio sinalização 1. O complexo Sec61 heterotrimeric na membrana ER fornece um caminho de solução aquosa de polipeptídeos recém-sintetizada para o lúmen do ER. Trabalhos recentes de vários laboratórios sugeriu que este complexo heterotrimeric também podem formar Ca 2 + transitória canais de vazamento 2-8. A observação fundamental para esta noção era que a liberação de polipeptídeos nascentes do ribossomo e Sec61 complexo puromicina leva à liberação transiente de Ca 2 + do ER. Além disso, havia sido observado in vitro que a proteína ER luminal BiP está envolvido na prevenção de permeabilidade de íons ao nível do Sec61 9,10 complexo. Nós estabelecemos um sistema experimental que nos permite abordar diretamente o papel do complexo Sec61 como potenciais canais de Ca + 2 de vazamento e para caracterizar a sua putativa mecanismos reguladores 11-13. Este sistema combina siRNA silenciamento gênico mediado e de células vivas Ca 2 + imagem 13. Células são tratadas com siRNAs que são dirigidos contra a codificação e região não traduzida (UTR), respectivamente, do gene SEC61A1 ou uma siRNA controle negativo. Na análise de complementação, as células são co-transfectadas com um vector IRES-GFP, que permite que o siRNA resistente à expressão do gene SEC61A1 tipo selvagem. Em seguida, as células são carregados com o Ca 2 + raciométrica indicador-FURA-2 para monitorar simultaneamente alterações na Ca 2 + citosólico concentração em um número de células através de um microscópio de fluorescência. A medição contínua de Ca 2 + citosólico também permite a avaliação do impacto de vários agentes, tais como puromicina, inibidores de molécula pequena, e tapsigargina em Ca 2 + vazamento. Este sistema experimental nos dá a oportunidade única de i) avaliar a contribuição de diferentes proteínas da membrana para ER passiva Ca 2 + efluxo do ER em vários tipos celulares, ii) caracterizar as proteínas e os mecanismos que limitam esse passivo Ca 2 + de efluxo e iii) estudar os efeitos das mutações doença ligada nos componentes relevantes.

O retículo endoplasmático desempenha um papel fundamental na biogênese de proteínas e na homeostase do cálcio. Nós estabelecemos um sistema experimental que nos permite abordar o papel dos canais de Ca2 + de vazamento e para caracterizar o suposto mecanismos de regulação. Este sistema envolve siRNA silenciamento gênico mediado e de células vivas Ca2 + imagem.

Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

Em células mamíferas, o retículo endoplasmático (RE) desempenha um papel fundamental na biogênese de proteínas, bem como na sinalização de cálcio1. O complexo heterotrimérico Sec61 ...

Em células de mamíferos, o retículo endoplasmático ou RE desempenha um papel importante na biogênese proteica e na sinalização de cálcio. O complexo heterotrimerico Sec61 na membrana do RE fornece um caminho aquoso para polipeptídeos recém-sintetizados entrarem no lúmen do RE. Dados recentes sugerem que o Sec61 também pode formar canais de vazamento de cálcio transitórios, o que leva a investigar diretamente o papel do complexo Sec61 como um possível canal de vazamento de cálcio.E para caracterizar seus mecanismos regulatórios putativos, as células são primeiramente tratadas com siRNAs direcionados contra o gene sex 61 A um. Na análise de complementação, as células são cotransfectadas com um vetor iris GFP que permite a expressão resistente ao irna do gene tipo selvagem sex 61 A um. Em seguida, as células são carregadas com o indicador ratiométrico de cálcio RO dois e as alterações na concentração citosólica de cálcio são monitoradas por microscopia de fluorescência.À medida que os níveis de cálcio são medidos, são realizadas mudanças na solução para avaliar o impacto de diversos agentes, como antagonistas da calmodulina e fábs de argônio, sobre o vazamento de cálcio. A análise quantitativa das imagens resultantes revela alterações no fluxo de cálcio F induzidas pelo silenciamento do sexo 61 A um. Neste vídeo, será apresentado um modelo para o papel do sexo 61 A um no fluxo de cálcio F após a demonstração do procedimento e a apresentação dos resultados.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como experimentos com bicamadas lipídicas artificiais ou medições em canais únicos, é que proteínas de membrana candidatas podem ser analisadas em seu ambiente nativo e sem a trabalhosa purificação e reconstituição funcional tipicamente ineficiente. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de sinalização de cálcio, tais como, por exemplo, qual é a contribuição de uma proteína específica da membrana do retículo endoplasmático para o fluxo de cálcio a partir do retículo endoplasmático em diferentes tipos celulares e como ela é regulada? Demonstrarão o procedimento Sway Long e Nico, dois talentosos estudantes de pós-graduação de nossos laboratórios. Inicie este procedimento preparando as soluções e reagentes a serem utilizados. Primeiro, prepare o tampão livre de cálcio de acordo com as instruções no protocolo escrito anexo.Em seguida, dilua uma solução estoque do indicador de cálcio. Dilua o Die fira 2:00 AM em um mililitro de DMEM contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina até uma concentração final de quatro micromolares. Dilua uma solução estoque de Apso Garin de um milimolar em tampão livre de cálcio até uma concentração final de três micromolares. Prepare também, à disposição, 200 micromolares de oleína A e 20 micromolares para reduzir o risco de estudar efeitos fora do alvo de um particular irna. Dois irnas diferentes são utilizados para silenciar cada gene, a fim de avaliar possíveis efeitos colaterais do procedimento de transfeção.Os siRNAs de controle negativo, compostos por uma sequência aleatória de nucleotídeos, são transfectados em paralelo com os siRNAs experimentais. É importante que o efeito do silenciamento mediado por RNA possa ser revertido pela expressão do DNA do tipo selvagem. Portanto, os siRNAs utilizados no experimento são especificamente selecionados para que o plasmídeo de resgate não seja afetado pelos siRNAs. Neste experimento, os siRNAs são direcionados contra ambas as regiões, a de revestimento e a não revestida, ou região não traduzida, abreviada como UTR, do gene de interesse.Quando os siRNAs são direcionados contra o resgate de UTR, plasmídeos sem o UTR endógeno podem ser usados para realizar a transfeção em células HeLa. Prepare as células para a transfeção colocando uma lamínula de 25 milímetros revestida com polilisina em cada placa de cultura celular de seis centímetros para cada transfeção; após uma hora, adicione 5,2 × 10⁵ células HeLa e meio DMEM suplementado a cada placa. Para transfectar as células, rotule um tubo de microcentrífuga.Para cada reação de transfeção, adicione a cada tubo quatro microlitros de siRNA a 20 micromolar dissolvido em 80 microlitros de OptiMEM. SEC61A1, SEC61A1 UTR e siRNA controle negativo são preparados em cada tubo. Adicione 20 microlitros do reagente de transfeção Hyperfect, vortexie suavemente e, em seguida, incube as reações à temperatura ambiente por 10 minutos. Para transfectar as células, adicione a mistura de siRNA (104 microlitros no total) gota a gota às células Hela aderidas e agite suavemente o recipiente para garantir distribuição uniforme dos complexos de transfeção.Incubar a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, substitua o meio por 3,9 mililitros de meio fresco. Em seguida, para aumentar a eficiência de transfeção, realize a transfeção uma segunda vez, utilizando a mesma mistura de irna. Para avaliar o silenciamento, realize análise por western blot.O silenciamento deve ser superior a 80%, como mostrado aqui para sex 61 A um. O efeito máximo de silenciamento é tipicamente observado 96 horas após a primeira transfeção, 48 horas após a primeira transfeção preparada para resgatar o fenótipo resultante do silenciamento de sex. 61, comece rotulando um novo tubo de microcentrífuga.Para cada reação, as células serão agora transfectadas com vetor vazio ou com plasmídeo de expressão do tipo selvagem sex. 61 A um. O plasmídeo de expressão do tipo selvagem utilizado aqui foi gerado pela inserção do cDNA do sex 61 A um no sítio de clonagem múltipla de um pcd.Um vetor GFP com três entradas ribossômicas internas contendo o promotor do citomegalovírus, a íris e a sequência codificadora da proteína verde fluorescente. Prepare o reagente de transfeção adicionando quatro microgramas de cada plasmídeo dissolvido em 80 microlitros de Opti-MEM a cada tubo. Em seguida, adicione a esta mistura 16 microlitros do reagente de transfeção FuGENE HD, vortexe suavemente esta solução e incube-a à temperatura ambiente por 10 minutos.Em seguida, após a troca do meio, adicione gota a gota a mistura de plasmídeo às células Heli 5,2 vezes 10 à quinta e agite suavemente o recipiente para garantir uma distribuição uniforme dos complexos de transfeção. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por mais 48 horas. Para determinar a eficiência de transfeção, avalie a expressão de GFP por microscopia de fluorescência.Após 48 horas, pelo menos 80% das células devem estar transfectadas. Antes da aquisição de imagens, use pinças para transferir as lamínulas com as células HeLa transfectadas para um novo recipiente de cultura celular de 3,5 centímetros e adicione um mililitro de DMEM com quatro micromolares.Se você for um incubado às 2:00 da manhã por 45 minutos a 25 graus Celsius no escuro. Para realizar a imagem, transfira a lamínula com menos duas células carregadas para uma câmara de gravação metálica e fixe-a no lugar apertando as duas partes da câmara juntas. Usando uma pipeta, adicione e remova 300 microlitros de tampão sem cálcio nas células para lavá-las.Repita, então, e monte a câmara de gravação em um microscópio I MIC com creme policromático cinco. Usando um conjunto de filtros para URA dois, localize um campo contendo pelo menos 20 células para estimar a fluorescência independente de cálcio da FU A dois. O comprimento de onda de excitação utilizado nesta etapa é de 360 nanômetros.Uma vez selecionado um campo adequado, configure o software de imagem para excitar em 340 nanômetros e 380 nanômetros e para medir a fluorescência emitida em 510 nanômetros a cada três segundos; ajuste o tempo de exposição para produzir intensidades de fluorescência em torno de 1000 unidades arbitrárias para a configuração mostrada aqui. Um tempo de exposição de cinco milissegundos é definido. Além disso, marque as regiões de interesse ou ROI para uma região de fundo livre de células e até 20 contornos celulares.Inicie a imagem de células vivas enquanto o experimento está em andamento; o sistema apresentará as imagens com métrica de razão para menos de dois sinais, bem como as razões F340/F380 em tempo real para cada ROI marcada como um gráfico de linhas, onde F340 e F380 correspondem à intensidade de fluorescência dentro das ROI em 340 e 380 nanômetros, respectivamente. Após um minuto, adicione as soluções de teste à câmara de imagem para avaliar diferentes parâmetros experimentais. Nestes experimentos, o antagonista da calmodulina, trifluoperazina, e a bolina A são testados após as medições com métrica de razão serem realizadas por mais 10 minutos.Para antagonistas modulares de CAL, adicione DSA gargan e prossiga com as medições. Registre 400 imagens pareadas por experimento. Após a coleta das imagens, revise-as e marque as ROI para pelo menos 20 células em cada campo de visão.Posteriormente, utilize a opção de análise cinética no software para criar uma sequência de imagens de razão com subtração de fundo e um gráfico mostrando a cinética da razão de cálcio com subtração de fundo. Para cada ROI, exporte finalmente os dados para o Excel e o Origin utilizando um método de calibração estabelecido. A concentração citosólica de cálcio pode ser calculada a partir das medidas de razão para examinar se o gene sex 61 A afeta o vazamento de cálcio do retículo endoplasmático.O gene sexo 61 A um foi silenciado por dois RNAs diferentes e as células helo foram mantidas por 96 horas. O silenciamento foi avaliado por análise de Western blot de números semelhantes de células em triplicata; conforme mostrado aqui, há um forte sinal de 6 61 alfa nas linhas um a três e um sinal significativamente mais fraco nas linhas quatro a seis e sete a nove, que correspondem às células com silenciamento do 6 61 A um. Para quantificar os resultados, os sinais de 6 61 alfa foram normalizados aos sinais de beta-actina; observou-se silenciamento superior a 80%. Isso foi realizado para testar o papel da calmodulina no fluxo de cálcio no retículo endoplasmático.A imagem URA dois de células sexuais 61 A de um senhor A tratadas com helo foi realizada na presença ou ausência do antagonista da calmodulina. Bollin A. Este filme mostra células controle tratadas com bollin a 10 minutos após o tratamento com bollin. A liberação de cálcio foi iniciada pela aplicação de FSO Gargan, um inibidor cíclico que revelou a liberação de cálcio do retículo endoplasmático na ausência de cálcio externo, como pode ser observado aqui.A adição de argão FSA levou a um aumento transitório, mas significativo, na fluorescência, indicando fluxo de cálcio F do retículo endoplasmático. Em contraste, o fluxo de cálcio F após a adição de garin FSO no osso PHE, em células silenciosas do sexo 61 A tratadas com A, é muito menos acentuado, como pode ser observado aqui. Essa diferença pode ser vista claramente neste diagrama, que mostra a estimativa do cálcio citosólico ao longo do tempo em uma série de filmes; os resultados quantitativos apresentados aqui confirmam o aumento do fluxo de cálcio em células controle em resposta ao argão thic na presença de bolina A, conforme pode ser visto neste gráfico de barras.O mesmo fenômeno foi observado para um segundo triazina antagonista de cam. No entanto, os efeitos dos antagonistas de cam não foram observados quando o complexo sex 61 foi esgotado das células por meio de um dos dois sex. 61 Um resgate parcial específico desse fenótipo pode ser observado quando células silenciosas de sex 61 A um foram transfectadas com sex.61 a um plasmídeo de expressão, como pode ser visto aqui. O fluxo de cálcio em resposta a agonistas da Cal Modulina é parcialmente restaurado com a transfeção do plasmídeo selvagem insensível ao irna. Esses resultados sugerem que a Cal Modulina está envolvida na limitação do fluxo de cálcio no retículo endoplasmático ao nível de um complexo de sex 61 nas células.Se for esse o caso, a transfeção do gene sex 61 A um com uma mutação dupla no sítio de ligação da calmodulina não deveria resgatar o fenótipo induzido por irna. De fato, quando as células foram transfectadas utilizando um plasmídeo de expressão sex 61 A um com uma mutação dupla no motivo IQ, não houve resgate do fenótipo considerado em conjunto. Esses dados indicam que a liberação de cadeias nascentes do complexo sex 61 realmente leva à liberação de cálcio do retículo endoplasmático e à formação de um nano domínio de cálcio ao redor da boca citosólica do complexo sex 61.Esse cálcio é ligado por Cal Moulin e o cálcio-Cal Moulin fecha o complexo sex 61. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como combinar o silenciamento gênico mediado por ARNi em células humanas com a imagem de cálcio em tempo real, seguindo este procedimento. Outros métodos, como a expressão de cDNAs com mutações associadas a doenças, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o impacto potencial de mutações associadas a doenças em componentes irrelevantes.E não se esqueça de que trabalhar com drogas como tap, novamente, pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

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Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

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Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

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Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Captador<sup-benzóico.</sup

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In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

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Aprenda a combinar silenciamento gênico por siRNA com imagens de cálcio em células vivas para estudar canais de vazamento de Ca²⁺ no retículo endoplasmático. Este método revela mecanismos regulatórios em sinalização celular.

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