Isolamento de neutrófilos de baixa densidade peritoneal: uma técnica para obter neutrófilos de baixa densidade a partir de fluido de lavagem peritoneal usando classificação de células ativadas por magnetismo

Os neutrófilos de baixa densidade, ou LDNs, são uma subpopulação distinta de neutrófilos encontrada em números elevados durante condições patológicas como câncer gastrointestinal. Os LDNs podem ser isolados das lavagens da cavidade peritoneal ou do fluido de lavagem dos pacientes.

Primeiro, filtre o fluido de lavagem para remover os detritos do tecido. Centrifugar o filtrado para obter um sedimento contendo células sanguíneas, incluindo LDNs. Ressuspendê-lo num tampão adequado. Colocar esta suspensão sobre um meio de gradiente de densidade adequado, ideal para isolamento LDN.

Centrifugue para separar os diferentes componentes do sangue com base em suas densidades relativas. As hemácias mais densas formam a camada inferior, enquanto a fração de plasma menos densa forma a camada superior. Os LDNs menos densos ocupam a camada intermediária junto com outras células mononucleares.

Transferir a camada intermédia para um novo tubo contendo um reagente bloqueador. Os componentes do reagente bloqueiam locais de ligação não específicos em todas as superfícies de células não-alvo e aumentam a especificidade para LDN durante a marcação subsequente.

Adicione microesferas conjugadas com anticorpos direcionadas a uma molécula específica da superfície celular superexpressa em LDNs. Incube para que os complexos anticorpo-esferas se liguem às suas moléculas-alvo em LDNs.

Passe a suspensão incubada através de uma coluna colocada em um campo magnético. Sob a influência magnética, todos os complexos de microesferas LDN aderem à parede da coluna enquanto as células não marcadas passam.

Remova a coluna. Lave o conteúdo usando um tampão adequado para eluir e coletar a fração contendo LDN.

Para adquirir os neutrófilos, primeiro, infunda 1 litro de solução salina estéril normal imediatamente antes do fechamento da ferida diretamente na cavidade abdominal de um paciente que acabou de ser submetido a cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal e lave a cavidade abdominal extensivamente por pelo menos 1 minuto. Em seguida, agite a solução salina dentro da cavidade e recupere 200 mililitros de fluido de lavagem com quatro seringas de 50 mililitros.

No laboratório, transfira o fluido de lavagem peritoneal através de um filtro de náilon de 100 micrômetros para tubos individuais de 50 mililitros para centrifugação. Ressuspenda os pellets em 5 mililitros de PBS suplementado com 0,02% de EDTA e sobreponha cuidadosamente cada suspensão celular em 3 mililitros de solução de gradiente de densidade. Após a separação do gradiente de densidade, colha 2 a 3 mililitros da camada intermediária de cada tubo e lave as amostras de fluido peritoneal em 10 mililitros de PBS fresco mais EDTA por tubo. Despeje os pellets em 10 mililitros de PBS fresco mais EDTA para uma lavagem adicional e dilua as células para 1 vezes 10 elevado à sétima célula por 60 micrômetros de classificação de células ativadas magnéticas, ou MACS, concentração de tampão.

Bloqueie qualquer ligação não específica com 20 microlitros de bloco Fc por 10 minutos a 4 graus Celsius, seguido pela adição de 20 microlitros de esferas magnéticas anti-CD66b. Após 10 minutos a 4 graus Celsius, lave e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão MACS e adicione as células a uma coluna magnética de tamanho apropriado dentro do campo magnético de um separador magnético adequado. Quando todas as células CD66b negativas tiverem passado pela coluna, adicione 15 mililitros de tampão MACS novo ao reservatório da coluna e transfira a coluna do separador magnético para um novo tubo cônico. Em seguida, mergulhe imediatamente a coluna para liberar o positivo CD66b marcado magneticamente no tubo.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.