Ensaio de influxo de cálcio para medir a captação de cálcio mitocondrial em células cultivadas

A captação mitocondrial de íons cálcio citosólicos através de seu complexo uniportador mitocondrial de membrana interna é crucial para seu funcionamento.

Para medir o influxo de cálcio mitocondrial, comece com uma placa de vários poços contendo uma lamínula revestida com ECM no fundo de seu poço. Coloque a suspensão de fibroblastos na lamínula e permita que as células adiram à MEC.

Adicione uma mistura de corantes contendo um corante inativo e esterificado sensível ao cálcio fluorescente vermelho e um corante seletivo para mitocôndrias verde-fluorescentes. Incubar para permitir que as moléculas do corante entrem no citosol celular.

O corante sensível às mitocôndrias se difunde seletivamente através de sua membrana e se localiza na matriz mitocondrial. O corante sensível ao cálcio se espalha por toda a mitocôndria e espaços extra-mitocondriais. Dentro do lúmen mitocondrial, as esterases endógenas clivam a porção éster do corante vermelho, liberando um fluoróforo vermelho impermeável à membrana que permanece preso dentro das mitocôndrias.

Adicione uma solução de permeabilização contendo surfactante. Em baixas concentrações, as moléculas de surfactante dissolvem de forma restritiva o colesterol da membrana plasmática das células, deixando suas mitocôndrias intactas e criando espaços através dos quais as moléculas de corante sensíveis ao cálcio vazam do citoplasma. Isso retém seletivamente os fluoróforos vermelhos sensíveis ao cálcio e os fluoróforos verdes específicos das mitocôndrias nas mitocôndrias.

Transfira a lamínula para uma câmara de imagem fixada em um microscópio confocal e adicione um tampão contendo cálcio. Dentro das células permeabilizadas, localize regiões que exibem fluorescência vermelha e verde colocalizada, indicando cálcio localizado nas mitocôndrias. A fluorescência vermelha aumenta gradualmente, representando a captação progressiva de cálcio mitocondrial.

Prepare a solução de trabalho Rhod-2/AM-MitoTracker Green misturando 20 microlitros de Rhod-2/AM, 0,2 microlitros de MitoTracker Green, 2,5 microlitros de F-127 plurônico a 20% e um mililitro da solução de Tyrode. Em uma lamínula previamente preparada com células NIH 3T3, adicione a solução Rhod-2 / AM-MitoTracker Green gota a gota até cobrir. Para que as células sejam carregadas com os corantes, incube a lamínula, protegida da luz por 30 minutos em temperatura ambiente.

Para desesterificar o Rhod-2 / AM, remova suavemente a solução Rhod-2 / AM-MitoTracker Green e substitua-a por aproximadamente 300 microlitros de solução fresca de Tyrode para cobrir as células. Incubar a lamínula protegida da luz, durante 30 minutos à temperatura ambiente.

Agora, transfira a lamínula para a câmara de imagem do microscópio e encha a câmara com solução de lavagem. Ajuste o foco para observar as células e o contraste de fase com ampliação de 40x.

Para permeabilizar a membrana plasmática das células carregadas de Rhod-2 / AM-MitoTracker Green, remova a solução de lavagem da lamínula e substitua-a por aproximadamente 300 microlitros de solução de permeabilização para cobrir as células.

Monitore a morfologia da membrana plasmática durante este processo. Quando permeabilizadas, as células desenvolverão uma superfície áspera. Remova a solução de permeabilização imediatamente, após a permeabilização completa, e substitua-a por solução interna de cálcio zero.

Em seguida, concentre-se nas células permeabilizadas exibindo uma co-localização clara de Rhod-2 e MitoTracker Green, para obter imagens de fluorescência de Rhod-2 e MitoTracker Green simultaneamente.

Em seguida, diminua o laser do microscópio e as configurações de ganho para tornar a fluorescência mitocondrial Rhod-2 fraca e pouco visível.

Para capturar a cinética das alterações mitocondriais de cálcio, selecione "Configurações do microscópio" para adquirir varreduras bidimensionais em uma taxa de quadros e curso de tempo apropriados. Remova a solução interna de zero cálcio, certificando-se de não perturbar as células e o foco do microscópio e, em seguida, inicie a aquisição da imagem.

Usando uma seringa, adicione manualmente a solução interna repleta de cálcio no ponto de tempo de 10 segundos. Finalmente, no software de aquisição de imagens, selecione as regiões de interesse para abranger as regiões de co-localização do sinal Rhod-2 e MitoTracker Green.