Ensaio de ramificação de glicogênio para medir o grau de ramificação de glicogênio

Polissacarídeos ramificados, como o glicogênio, compreendem resíduos de glicose ligados linearmente por meio de ligações alfa-1,4-glicosídicas e em ramos por ligações alfa-1,6-glicosídicas.

Para determinar o grau de ramificação em polissacarídeos, comece com um reagente aquoso de cor contendo iodeto de potássio, iodo e cloreto de cálcio. Em condições aquosas, o iodeto de potássio e o iodo produzem íons iodeto.

Em tubos de microcentrífuga separados, misture o reagente com polissacarídeos de estruturas ramificadas conhecidas e uma amostra de glicogênio com uma estrutura não caracterizada.

Os polissacarídeos adotam estruturas helicoidais por meio de suas ligações alfa-1,4-glicosídicas. Os íons iodeto se ligam a esse núcleo helicoidal, formando cadeias lineares de poliiodeto. Isso resulta na formação de complexo de transferência de carga entre os polissacarídeos e as cadeias de poliiodeto, resultando em complexos polissacarídeos-iodeto coloridos.

Os polissacarídeos não ramificados com cadeias de poliiodeto mais longas desenvolvem uma cor azul, enquanto os polissacarídeos ramificados com cadeias de poliiodeto mais curtas desenvolvem complexos amarelados a marrom-alaranjados. O cloreto de cálcio no reagente intensifica a cor complexa.

Transfira a mistura para cubetas descartáveis. Usando um espectrofotômetro, meça o espectro de absorbância de 330 a 800 nanômetros.

Complexos não ramificados com uma cor azul absorvem a luz em comprimentos de onda mais longos, demonstrando um deslocamento para a direita nos máximos de absorbância. Em contraste, os complexos ramificados absorvem luz em comprimentos de onda mais curtos, com o deslocamento para a esquerda nos máximos de absorbância indicando maior ramificação na estrutura.

A absorbância máxima da amostra de glicogênio não caracterizada em aproximadamente 450 nanômetros confirma sua estrutura ramificada.

Para determinar a ramificação do glicogênio, combine 650 microlitros de estoque de reagente corante de iodo/cloreto de cálcio com 100 microlitros de água em um tubo de 1,5 mililitro e misture bem a solução antes de transferir para uma cubeta de metacrilato descartável. Colocar a cubeta no espectrofotómetro para realizar uma corrida em modo de varrimento do comprimento de onda para recolher o espectro de fundo de 330 a 800 nanómetros.

Em um tubo separado de 1,5 mililitro, combine 650 microlitros do reagente corante de iodo / cloreto de cálcio com 50 microgramas de glicogênio de ostra e complete o volume final para 750 microlitros com água. Depois de misturar bem a mistura, transfira a solução para uma cubeta de metacrilato descartável para coletar um espectro de absorção de 330 a 800 nanômetros.

Da mesma forma, obtenha um espectro de absorção com 50 microgramas de amilopectina e 30 microgramas de amilose, conforme descrito anteriormente.

Para obter uma indicação da estrutura ramificada de uma amostra de glicogênio não caracterizada, combine 25 a 50 microgramas de glicogênio com 650 microlitros do reagente de cor iodo/cloreto de cálcio de trabalho e proceda conforme explicado anteriormente para adquirir o espectro de absorção.