Dot Blot de 5-metilcitosina para determinar a extensão da metilação do DNA

A metilação do DNA é uma modificação epigenética que envolve a adição de um grupo metil à base de citosina do DNA para formar 5-metilcitosina. Essa modificação altera a expressão gênica.

Para quantificar a metilação do DNA via dot-blot, colete amostras de DNA genômico derivadas de condrócitos humanos em vários estágios de desdiferenciação que exibem diferentes níveis de citosina metilada.

Trate as amostras de DNA com hidróxido de sódio - um álcali forte - e aqueça-as. Este tratamento quebra as ligações de hidrogênio entre as duas fitas de DNA, resultando na desnaturação do DNA. Adicione acetato de amônio para neutralizar o álcali, evitando a degradação excessiva do DNA.

Pegue uma membrana de náilon e identifique amostras de DNA desnaturadas como pontos. O DNA carregado negativamente se liga à membrana de náilon carregada positivamente por meio de interações eletrostáticas, resultando em seu borrão no suporte sólido.

Trate a membrana borrada com um tampão de bloqueio para evitar ligações inespecíficas. Em seguida, adicione anticorpos anti-5-metilcitosina à membrana e incube. Esses anticorpos se ligam exclusivamente à citosina metilada no DNA.

Lave para remover os anticorpos não ligados e adicione anticorpos secundários conjugados com enzimas quimioluminescentes que se ligam especificamente aos anticorpos primários.

Adicione um substrato quimioluminescente à membrana. A enzima no anticorpo reage com o substrato para produzir quimioluminescência - produzindo pontos de várias intensidades.

Visualize a membrana e meça as intensidades dos pontos, que correspondem à extensão da metilação do DNA em cada amostra.

Inicie este procedimento desnaturando o DNA isolado em hidróxido de sódio 0,1 molar por 10 minutos a 95 graus Celsius. Neutralizar o ADN com acetato de amónio 1 molar em gelo e, em seguida, diluir duas vezes com água bidestilada

A etapa mais crítica no dot blot é a localização das amostras na membrana, faça-o devagar e com cuidado. Tente minimizar cada área manchada para 3 a 4 milímetros de diâmetro.

Usando uma ponta de pipeta de boca estreita, posicione cuidadosamente 2 microlitros do DNA genômico diluído em série em uma membrana de náilon carregada positivamente no centro da grade. Seque a membrana a 80 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, bloqueie os locais de ligação de anticorpos não específicos embebendo a membrana em 5% de BSA em TBST em uma placa de Petri de 10 centímetros por 1 hora em temperatura ambiente com agitação suave.

Após 1 hora, lave a membrana três vezes em TBST por 5 minutos de cada vez. Incube a membrana com um anticorpo monoclonal anti-5-metilcitosina de camundongo em TBST a 4 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave a membrana três vezes em TBST por 5 minutos de cada vez.

Em seguida, incube com um anticorpo secundário - imunoglobulina G de ovelha conjugada com peroxidase de rábano em TBST por uma hora em temperatura ambiente. Depois de lavar a membrana em TBST como antes, adicione o substrato enzimático à membrana e incube por 5 a 10 minutos. Por fim, visualize o sinal do anticorpo secundário usando um kit de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante.