Um ensaio in vitro para avaliar o impacto imunomodulador dos monócitos na proliferação de leucócitos

Pegue uma placa de vários poços com cultura de células-tronco mesenquimais aderentes, ou MSC.

Adicione células mononucleares do sangue periférico, ou PBMCs, e incube.

As CTMs secretam fator de crescimento de hepatócitos, induzindo os monócitos a adquirir um fenótipo imunomodulador, produzindo interleucina-10 ou IL-10.

Transferir o sobrenadante contendo PBMC para um tubo.

Adicione grânulos magnéticos revestidos com anticorpos ao marcador de superfície de monócitos CD14.

Use um separador magnético para isolar os monócitos CD14+ e adicione-os a poços de placas de vários poços em concentrações crescentes.

Introduza células T CD4+ efetoras marcadas com CFSE de corante fluorescente.

Adicione microesferas conjugadas com anticorpos ligando-se especificamente aos marcadores de superfície de células T CD3 e CD28, ativando as células.

No controle de monócitos bem ausentes, as células T ativadas proliferam, com cada divisão celular diminuindo a intensidade de fluorescência do CFSE nas células-filhas.

No entanto, em co-culturas, os monócitos induzidos por MSC secretam IL-10, suprimindo a proliferação de células T efetoras.

Usando citometria de fluxo, observe menos células T exibindo intensidades de fluorescência CFSE reduzidas com concentrações crescentes de monócitos, indicando a supressão da proliferação de células T efetoras por monócitos induzidos por MSC.

Para realizar um ensaio de supressão de efetores, comece configurando uma co-cultura MSC-PBMC com 2,5 x 10⁶ PBMCs, co-cultivada com 250.000 MSCs para garantir PBMCs co-cultivados MSC suficientes para seleção de subpopulação.

Após 48 a 72 horas a 37 graus Celsius, selecione os leucócitos imunomoduladores induzidos por MSC de interesse com as esferas magnéticas apropriadas. Em seguida, adicione células T CD4-positivas alogênicas marcadas com CFSE em 1 mililitro de meio leucocitário completo por poço, em várias proporções experimentais.

Em seguida, adicione microesferas conjugadas anti-CD3 / 28 em uma proporção de 1 para 1 grânulo para célula para estimular as células T CD4-positivas. No terceiro dia de co-cultura, avaliar a proliferação das células T CD4-positivas marcadas com CFSE por citometria de fluxo.