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Comece com um dispositivo microfluídico revestido de polímero que compreende poços reservatórios conectados por canais e preenchidos com meio de cultura.
Remova o meio dos reservatórios e semeie células-tronco pluripotentes induzidas por humanos.
As células entram nos canais e aderem à superfície revestida.
Agora, encha os reservatórios com um meio de diferenciação.
Os fatores de crescimento no meio induzem a diferenciação de células-tronco em células progenitoras neuronais.
Em seguida, adicione um meio contendo nutrientes específicos e fatores neurotróficos que induzem a maturação do progenitor neuronal em neurônios glutamatérgicos.
Esses neurônios liberam o neurotransmissor excitatório glutamato de seus terminais pré-sinápticos, que se ligam aos receptores de neurônios pós-sinápticos, gerando sinais excitatórios.
Agora, pegue as células de glioma pediátricas de alto grau, células cancerígenas derivadas de tumores cerebrais agressivos.
Adicione as células aos reservatórios e incuba. As células do glioma entram nos canais e aderem.
Gradualmente, essas células formam sinapses funcionais com os neurônios glutamatérgicos, facilitando a diafonia das células neuronal-glioma e levando à hiperatividade neuronal.
Para começar a cultivar os neurônios glutamatérgicos corticais derivados de iPS humanos comercializados, esvazie os reservatórios de entrada e saída do dispositivo microfluídico por aspiração de pipeta, deixando apenas os canais do dispositivo serem preenchidos com meio.
Semeie as células iPS humanas adicionando 10 microlitros de 6,5 milhões de células iPS humanas por mililitro de suspensão no meio e deixe o dispositivo sob o capô por 15 minutos para permitir que as células se conectem. Após 15 minutos, encha os reservatórios de entrada e saída com 50 microlitros de meio de cultura do dia 4. Em seguida, transfira o dispositivo para a incubadora para manter as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 23 dias. Substitua o meio a cada 3 a 4 dias, conforme descrito no texto.
Para contar as células e avaliar a viabilidade usando um microscópio de contraste de fase padrão, tire fotos microscópicas no 4º dia, 21º dia e 23º dia. Cultura de linhagens celulares UW-479 e BT-35 em DMEM e glutamax F-12 suplementado com 10% de soro fetal bovino em frasco de cultura celular. Manter a cultura de células em um ambiente controlado a 37 graus Celsius em condições normóxicas durante os experimentos. Observe cada linha celular para atingir 80% de confluência.
No dia 21 pós-cultura de neurônios glutamatérgicos, inicie a co-cultura tripsinizando células UW-479 e BT-35. Semeie as células tripsinizadas UW-479 e BT-35 em cima dos neurônios glutamatérgicos aderentes maduros em cada dispositivo microfluídico dedicado.
Manter as co-culturas por dois dias em ambiente controlado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com neurônio glutamatérgico D11 e meio posterior. Conte as células pediátricas de glioma de alto grau usando as imagens microscópicas, analisadas com o software de análise de imagem para avaliar sua viabilidade e calcular a porcentagem de células.
