Isolamento e cultura de neurônios granulares cerebelares primários de camundongos

Pegue um cérebro de filhote de rato recém-colhido.

Separe o cerebelo e remova sua camada membranosa.

Do lado ventral, remova a rede de vasos sanguíneos.

Pique o cerebelo em fragmentos e transfira-os para um tubo contendo tampão.

Centrifugue e descarte o sobrenadante contendo detritos.

Adicione tripsina, uma enzima proteolítica, para digerir a matriz extracelular do tecido e soltar as células.

Adicione um tampão contendo inibidor de tripsina e DNase.

O inibidor interrompe a atividade da tripsina enquanto a DNase degrada qualquer DNA contaminante.

Dissocie mecanicamente o tecido para formar uma suspensão celular, incluindo neurônios granulares cerebelares e células não neuronais ou gliais.

Transfira a suspensão celular para um tubo.

Adicione buffer. Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células no meio e coloque-as em placas de cultura revestidas com poli-D-lisina.

As células se ligam às superfícies revestidas.

Adicione um antimetabólito para eliminar as células gliais em proliferação e gerar uma cultura pura de neurônios granulares cerebelares.

Para isolar o cerebelo, coloque o cérebro na solução de dissecção suplementada com sulfato de magnésio e mantenha a solução e o cérebro no gelo.

Sob um microscópio de dissecação, remova as meninges usando uma pinça fina. Em seguida, disseque o cerebelo do cérebro em solução de dissecção suplementada com sulfato de magnésio. Isso ajuda a descascar as meninges restantes e permite que se entre as camadas para limpar as dobras cerebelares.

A presença de meninges na cultura neuronal resulta em células não saudáveis e eventual morte celular. Como tal, é importante garantir a remoção completa das meninges antes de prosseguir com a cultura.

Depois disso, vire o cerebelo para o lado ventral e garanta a remoção do plexo coróide. Em seguida, agrupe o cerebelo em um prato de 35 milímetros contendo 1 mililitro de solução de dissecação suplementada com sulfato de magnésio. Pique os tecidos em pedaços pequenos e transfira-os para um tubo de 50 mililitros contendo 30 mililitros de solução de dissecação tamponada com sulfato de magnésio.

Nesta etapa, centrifugue o tubo de 50 mililitros contendo o tecido cerebral picado por cinco minutos a 644 vezes g e 4 graus Celsius. Depois disso, remova o sobrenadante e adicione 10 mililitros de solução de dissecção de tripsina. Em seguida, agite a mesa em alta velocidade por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Adicione 10 mililitros de solução inibidora de tripsina-I ao tubo e balance suavemente por dois minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por cinco minutos a 644 vezes g e 4 graus Celsius. Após cinco minutos, remova o sobrenadante e adicione 2 mililitros de solução inibidora de tripsina-II antes de transferi-lo para um tubo de 15 mililitros.

Em seguida, triture o tecido no tubo de 15 mililitros até que a solução fique turva. Deixe repousar por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante transparente e transfira-o para um novo tubo contendo 1 mililitro de solução de dissecção suplementada com cloreto de cálcio.

Adicione mais 2 mililitros de solução inibidora de tripsina-II no fundo do tubo que contém o pellet. Triture novamente e deixe repousar por cinco minutos. Remova o sobrenadante e adicione-o ao tubo contendo o sobrenadante da etapa anterior. Repita esse processo até que a maior parte do tecido esteja mecanicamente dissociada.

Adicione 0,3 mililitros de solução de dissecção suplementada com cloreto de cálcio à coleção de sobrenadantes para cada mililitro de sobrenadante. Misturar o conteúdo do tubo e centrifugar durante cinco minutos a 644 vezes g à temperatura ambiente. Depois disso, remova o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de mídia fresca ao pellet e misture.

Em seguida, conte as células vivas e dilua-as até uma concentração de 1,5 x 10⁶ células por mililitro. Coloque as células nas placas de poli-D-lisina previamente preparadas. Para placas de quatro poços, coloque 0,5 mililitros da amostra, dando 7,5 x 10⁵ células por poço. Para pratos de 35 milímetros, coloque 4 mililitros da amostra, dando 6 x 10⁶ células por placa. Para lamínulas, placa 0,5 ml, dando 7,5 x 10⁵ células por poço.

Após 24 horas, adicione AraC duas placas para reduzir a contaminação glial. Se as células forem mantidas por sete a oito dias, repita este tratamento no dia 3 e mantenha as culturas em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 graus Celsius.