Obtenção de uma cultura mista de oligodendrócitos e astrócitos a partir de células-tronco neurais de camundongos adultos

Pegue uma fatia de cérebro de camundongo coronal.

Identifique os ventrículos laterais, as cavidades em forma de C no cérebro e isole as paredes do ventrículo.

Coloque o tecido em um tampão contendo tripsina para degradar a matriz extracelular, liberando as células.

Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células em um meio.

Coloque as células em placas e incube-as verticalmente para mantê-las em suspensão.

Adicione fatores de crescimento que induzem a proliferação e agregação de células-tronco neurais para formar neuroesferas tridimensionais.

Colha as neuroesferas, centrifugue e descarte o sobrenadante.

Adicione meio fresco e dissocie mecanicamente as neuroesferas.

Coloque as células em placas e adicione um meio contendo fatores de crescimento que induzem a diferenciação de células-tronco neurais em precursores de oligodendrócitos.

Os precursores proliferam e formam oligosferas.

Dissocie mecanicamente as oligoesferas para liberar os precursores.

Semeie os precursores em poços revestidos de proteínas da matriz extracelular para facilitar a ligação celular.

Adicione um meio contendo hormônios específicos e fatores neurotróficos para induzir a maturação do precursor em oligodendrócitos e astrócitos.

Para o isolamento de células-tronco neurais da zona subventricular de camundongos adultos de 2,5 meses de idade, coloque cérebros de quatro a cinco camundongos adultos em um tubo de 50 mililitros de HBSS gelado e coloque um cérebro com o lado ventral voltado para baixo na direção rostrocaudal em um frasco estéril coberto de papel alumínio cheio de água fria de -20 graus Celsius durante a noite. Use uma lâmina de barbear para remover os bulbos olfatórios e cortar duas a três fatias coronais de um milímetro de espessura do córtex até o quiasma óptico. Coloque os cortes na superfície fria em posição ventro-dorsal e identifique o corpo caloso e os dois ventrículos laterais. Com magnificação, isole as paredes dos ventrículos laterais, tomando cuidado para não incluir pedaços do corpo caloso, e coloque o tecido isolado em 5 a 10 mililitros de tampão de dissociação enzimática para uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, pipetar os tecidos pelo menos 50 vezes antes de incubar as amostras a 37 graus Celsius por mais 10 minutos. No final da incubação, neutralizar a tripsina com 5 mililitros de meio de cultura padrão e filtrar a suspensão tecidual através de um filtro de 70 mícrons. Centrifugar a solução filtrada durante cinco minutos a 400 vezes g e ressuspender o sedimento em solução de sacarose para uma segunda centrifugação. No final da centrifugação, ressuspender o sedimento em solução de lavagem de albumina de soro bovino para outra centrifugação, em seguida, ressuspender o sedimento em meio de cultura padrão para contagem e colocar as células em um balão vertical T25 ou T45.

Para diferenciação primária da neuroesfera, adicione fibroblastos básicos e fatores de crescimento endotelial à cultura de células-tronco neurais a cada dois dias. Quando as neuroesferas atingirem um diâmetro de 100 a 500 mícrons, passe as células por dissociação mecânica de acordo com protocolos padrão.

Para diferenciação da oligosfera, trate as células com fator de crescimento básico de fibroblastos e fator AA derivado de plaquetas a cada dois dias. Quando as oligoesferas atingirem um diâmetro de 100 a 150 mícrons, dissocie as esferas por dissociação mecânica de acordo com os protocolos padrão e semeie a suspensão celular a uma densidade de 3.000 células por centímetro quadrado em placas revestidas com lamina de poli-D / L-ornitina. Após três dias, substituir o sobrenadante de cada cultura pelo mesmo volume de meio de diferenciação de oligodendrócitos.