Isolamento e cultura de células primárias de Schwann de uma derme humana

Pegue pedaços de derme humana isolada contendo vários tipos de células, incluindo fibroblastos, células de Schwann e células imunológicas, incorporadas em uma matriz de colágeno.

Pique o tecido em pequenos fragmentos.

Adicione colagenase, uma enzima proteolítica, para digerir as fibras de colágeno do tecido, soltando as células.

Dissociar mecanicamente o tecido, obtendo uma suspensão celular.

Passe as células por um filtro de células, removendo os agregados celulares e os detritos do tecido.

Adicione meios contendo soro à suspensão celular para interromper a atividade da colagenase.

Centrifugue e descarte o sobrenadante contendo colagenase.

Ressuspender as células em meio e colocá-las num balão de cultura revestido de poli-L-lisina.

Incube para que as células adiram à superfície revestida.

Remova a mídia que contém células não aderentes. Lave com tampão.

Incubar com um agente antimitótico para eliminar células que se dividem rapidamente, como fibroblastos.

Remova a mídia. Lave com tampão para remover quaisquer agentes antimitóticos restantes.

Adicione meios de cultura específicos para células de Schwann e incuba, facilitando o crescimento das células de Schwann.

Pré-revestir os frascos T25 com poli-L-lisina ou PLL, usando 5 mililitros de DPBS, e colocar os frascos pré-revestidos a 37 graus Celsius por três horas. Posteriormente, lave a matriz de revestimento PLL duas vezes com DPBS. Depois de lavar os pedaços isolados da derme com 5 mililitros de meio basal DMEM, pique a derme em pedaços pequenos com uma tesoura.

Digerir a derme picada com 5 mililitros de colagenase a 37 graus Celsius por 2 horas e meia, com trituração suave usando uma ponta de pipeta a cada 30 minutos até que a derme se dissocie completamente. Uma vez digerida, filtre a suspensão celular com um filtro celular de 70 micrômetros, seguido de diluição da suspensão celular filtrada com 5 mililitros de meio DMEM completo para interromper a atividade enzimática da colagenase.

Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 870 vezes g por 5 minutos à temperatura ambiente e ressuspenda o pellet celular em 2 mililitros de meio completo DMEM para dividir as células. Depois de repetir o processo de centrifugação conforme descrito, aspire o sobrenadante para usar o pellet celular para isolar as células de Schwann ou fibroblastos.

Para isolar as células de Schwann, ressuspenda o pellet celular em 5 mililitros de meio completo DMEM fresco e quantifique o número e a viabilidade das células antes de semear 5 mililitros das células ressuspensas em frascos T25 pré-revestidos a uma densidade de 4,0 vezes 10 elevado a 3 células por mililitro. Incubar o frasco a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 16 horas, confirme a adesão celular por microscopia com aumento de 10x. Em seguida, remova as células não aderentes e lave o frasco três vezes com 5 mililitros de DPBS.

Em seguida, incube as células com 5 mililitros de arabinosídeo de citosina 10 micromolares em um meio completo de DMEM. Após 24 horas, aspirar o meio contendo citosina arabinosídeo antes de enxaguar o balão. Reabasteça o frasco de cultura com 5 mililitros de meio de cultura completo de células de Schwann para incubar por 48 horas enquanto atualiza o meio em dias alternados até que as células de Schwann atinjam 80% de confluência.