Gerando explante de gânglio da raiz dorsal e cultura de células dissociadas

Comece com o gânglio da raiz dorsal ou tecidos DRG em meio sem soro. O tecido DRG contém neurônios sensoriais e células gliais satélites embutidas na matriz extracelular, ECM.

Semeie-os em uma placa de cultura revestida com uma mistura de proteínas gelatinosas para melhorar a adesão do tecido.

Com o tempo, as células gliais liberam fatores de crescimento neurotróficos que permitem extensões neuronais, estabelecendo uma cultura de explante DRG.

Para desenvolver uma cultura de células dissociadas, tome esses explantes DRG em um tubo. Trate-os com colagenase para degradar a ECM e depois com tripsina, que interrompe as conexões celulares, liberando neurônios e células gliais.

Adicione um meio enriquecido com soro para interromper a reação enzimática.

Pipete o conteúdo repetidamente para criar uma suspensão de célula única e filtre-o para remover detritos.

Centrifugue esta suspensão celular e remova o sobrenadante contendo enzimas.

Ressuspenda as células em um meio neurobasal e transfira-as para uma placa revestida de laminina.

As células gliais satélites e os neurônios sensoriais aderem à placa revestida de laminina, estabelecendo uma cultura de células dissociada.

Transfira cada DRG para uma placa de Petri de vidro seca. Sob um microscópio cirúrgico, limpe e apare o excesso de fibras e tecido conjuntivo ainda preso ao DRG usando uma lâmina. O DRG é facilmente identificável como uma estrutura volumosa e transparente ao longo do nervo espinhal branco e os vasos sanguíneos são frequentemente encontrados ao redor do DRG.

Depois disso, coloque o DRG limpo em uma nova placa de Petri contendo meios gelados e sem soro. Dilua a mistura de proteínas gelatinosas em meios gelados e sem soro na proporção de 1 para 1. Em seguida, coloque o DRG ex vivo nas placas de 12 poços, pré-revestidas com 10 ou 20 microlitros de mistura de proteínas gelatinosas, e mantenha-as a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos.

Agora, adicione suavemente 1,5 a 2 mililitros de meio sem soro ao sistema de cultura para cobrir todo o explante e manter os explantes em condições de cultura. Troque o meio de crescimento DRG a cada 72 horas. e deixar o DRG crescer pelo tempo que for necessário.

Esta é uma etapa crítica, pois o DRG é ancorado à placa de vidro usando a mistura de proteínas gelatinosas. Portanto, o tempo de polimerização e as habilidades de pipetagem são fundamentais para evitar a flutuação.

Neste procedimento, coloque todo o DRG coletado em um tubo estéril de 1,5 mililitro com meio F12 contendo colagenase IV e incube-o a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, substitua o meio fresco contendo colagenase IV e incube a amostra por mais 45 minutos. Em seguida, trate os explantes com 2 mililitros de meio F12 contendo 0,025% de tripsina a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Imediatamente após o tratamento com colagenase IV, incube-os com 2 mililitros de meio F12 contendo soro fetal bovino a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, lave os explantes três vezes com 2 mililitros de meio F12 e proceda a dissociá-los mecanicamente com uma pipeta de vidro, até que o meio fique turvo.

Em seguida, filtre a cultura de células dissociadas através de um filtro de 0,22 micrômetro para remover quaisquer impurezas e excesso de tecido conjuntivo. Em seguida, centrifugue o lisado de células filtradas durante dois minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de meio neurobasal. Coloque as células dissociadas em lâminas de cobertura revestidas com laminina em uma densidade celular preferida.