Estabelecendo uma cultura de células gliais de Müller obtida de retinas de camundongos

Pegue retinas de camundongos contendo células Müller Glial, ou MG, e neurônios.

Coloque-os em uma solução de dissociação com enzimas digestivas e incube com um balanço suave para garantir uma distribuição uniforme das enzimas.

Essas enzimas quebram a matriz extracelular, separando células individuais.

Pipete as retinas para cima e para baixo várias vezes para liberar as células.

Adicione um inibidor para interromper a atividade enzimática e centrifugue.

Descarte o sobrenadante.

Ressuspenda as células em meios contendo um fator de crescimento específico das células MG.

Transfira as células para um poço e incuba.

Com o tempo, o fator de crescimento no meio facilita o crescimento e a multiplicação das células MG, enquanto as células neuronais que não se dividem perecem.

Remova a mídia. Lave com um tampão de sal.

Incube com uma enzima digestiva para separar as células do poço.

Recolha as células num tubo e centrifugue.

Descarte o sobrenadante que contém as células neuronais mortas.

Ressuspenda as células MG em meio para análise posterior.

Prepare a mistura de dissociação de papaína DNase I conforme descrito no manuscrito. Agora, com uma pipeta de transferência com ponta alargada, pegue as retinas. Espere até que as retinas se assentem na parte inferior da ponta e libere as retinas, sem HBSS excessivo, no tubo contendo a mistura de papaína DNase I.

Em seguida, coloque o tubo em um nutador na incubadora e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius e com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, dissocie as células pipetando cuidadosamente para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mililitro. Depois que as células forem dissociadas, adicione 275 microlitros de inibidor de protease ovomucóide do kit de dissociação de papaína para neutralizar a papaína e misture suavemente pipetando para cima e para baixo.

Coloque os tubos em uma centrífuga e gire a 4 graus Celsius por 8 minutos a uma força centrífuga relativa de 300. Adicione o fator de crescimento epidérmico ao volume calculado do meio de crescimento pré-aquecido a 37 graus Celsius. Remova os tubos cuidadosamente da centrífuga.

Sem tocar no pellet no fundo do tubo, remova o sobrenadante com cuidado e completamente. Agora, ressuspenda o pellet celular com 500 microlitros de meio de crescimento suplementado com fator de crescimento epidérmico. Em seguida, transfira a suspensão celular para um poço da placa de 12 poços rotulada. Enxágue o tubo com mais 500 microlitros do meio de crescimento suplementado com fator de crescimento epidérmico e adicione-o ao poço.

Balance a placa do poço com cuidado. Em seguida, coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius com dióxido de carbono. Comece verificando se há 90% a 100% de confluência celular. Em seguida, remova o meio e adicione 1 mililitro de HBSS frio para lavar o poço. Balance suavemente a placa e remova o HBSS sem deixar vestígios.

Mais tarde, adicione 500 microlitros de uma solução contendo tripsina pré-aquecida para separar as células do poço. Balance suavemente e incube por 2 minutos em uma incubadora de 37 graus Celsius. Depois de mover a placa da incubadora para o gabinete de biossegurança, aspire a solução contendo tripsina enquanto inclina. Disperse-o com cuidado e lentamente sobre o poço várias vezes, até que as células se desprendam completamente.

Em seguida, transfira essa suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mililitro e coloque os tubos na centrífuga. Gire a 300 vezes g por 8 minutos a 4 graus Celsius e traga os tubos de volta para o gabinete de biossegurança. Remova o sobrenadante sem tocar no pellet. Agora, ressuspenda cuidadosamente o pellet celular adicionando 600 microlitros de meio de crescimento pré-aquecido e pipetando para cima e para baixo aproximadamente 30 a 40 vezes.