in vivo Imagens de cálcio usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em Drosophila melanogaster

Conserte uma mosca com o cérebro exposto em uma câmara de imagem.

A mosca expressa um indicador de cálcio geneticamente codificado, ou GECI localizado nos dendritos do corpo do cogumelo, ou neurônios MB.

Conecte a mosca com fios elétricos e posicione uma agulha de entrega de odor perto de sua antena.

Adicione uma gota tampão no cérebro exposto, posicione a mosca sob um microscópio e conecte a agulha a um sistema de entrega de odor.

Excite o GECI e forneça um estímulo de odor.

O odorante se liga aos receptores de neurônios sensoriais da antena, gerando potenciais de ação.

Os potenciais de ação se propagam dos neurônios sensoriais para os neurônios de projeção, induzindo a liberação de neurotransmissores e facilitando o influxo de cálcio e a fluorescência do GECI nos neurônios MB pós-sinápticos.

Repita com um segundo e terceiro odor.

Em seguida, aplique o primeiro odor com um choque elétrico e o segundo sem.

Finalmente, entregue os três odores sem choques. Registre a fluorescência.

Uma fluorescência reduzida em resposta ao estímulo associado ao choque em comparação com os controles revela plasticidade sináptica induzida pelo aprendizado.

Para visualização dos indicadores de cálcio baseados em GFP, ajuste o laser de um microscópio multifotônico equipado com um laser infravermelho e uma objetiva de imersão em água instalada em uma mesa isolada por vibração, para um comprimento de onda de excitação de 920 nanômetros e instale um filtro passa-banda GFP. Usando o botão de ajuste Z grosso, examine o eixo Z do cérebro para localizar a região cerebral de interesse.

Use a função Cortar para focar a varredura apenas na área de interesse para minimizar o tempo de varredura e gire a visualização de varredura de forma que a parte anterior da cabeça fique voltada para baixo. Em seguida, ajuste o tamanho do quadro para 512 por 512 pixels e selecione a região a ser verificada, levando em consideração o tempo de varredura calculado para cada quadro para atingir uma taxa de quadros de pelo menos 4 hertz.

Para visualização de transientes de cálcio evocados por odor, inicie um macropacote pré-programado capaz de vincular o software de aquisição de imagem no programa de entrega de odor e inicie a medição no software do microscópio por 6,25 segundos para estabelecer um valor de linha de base F0.

No sistema de entrega de odor, forneça um estímulo de odor de 2,5 segundos indicado aqui pela iluminação de LEDs acionados pela abertura e fechamento de válvulas de copo de odor específicas, seguido por 12,5 segundos de gravação no final do deslocamento de odor. Em seguida, repita a entrega por um segundo e terceiro odorante da mesma maneira.

Para realizar o condicionamento associativo nesta configuração, use o sistema de entrega de odor controlado por computador para apresentar o estímulo condicionado mais o odor por 60 segundos ao lado de choques elétricos de 12 a 90 volts. Após um intervalo de 60 segundos, apresente o estímulo condicionado menos o odor sozinho por 60 segundos sem choque elétrico. Meça novamente a transitoriedade de cálcio evocada por odor pós-treino, repetindo o protocolo de estimulação de odor pré-treino, três minutos após o término da fase de treinamento