Estudando o efeito de pesticidas nos neurônios de Caenorhabditis elegans

Comece com uma placa de ágar contendo Caenorhabditis elegans transgênicos expressando proteínas fluorescentes verdes ou GFPs em seus neurônios.

Adicione água estéril ao prato, gire-o para levantar as minhocas e transfira-as para um tubo.

Deixe os vermes assentarem, remova o excesso de água e ressuspenda-os.

Transfira os vermes ressuspensos para uma placa revestida com pesticida e uma placa de controle sem pesticida e, em seguida, incube.

Com base em suas ações, o pesticida danifica especificamente certos neurônios e causa inchaço neuronal, diminuindo a expressão de GFP.

Transfira os vermes para uma almofada de agarose que contenha um agente anestésico e, em seguida, coloque uma lamínula.

Monte a lâmina em um microscópio fluorescente. Primeiro, visualize os vermes usando o modo de contraste de fase e, em seguida, mude para o modo de fluorescência.

Em vermes tratados com pesticidas, os neurônios exibem fluorescência reduzida, somas inchados e lacunas nos processos neuronais, indicando efeitos neurodegenerativos.

Enquanto estão no controle, os neurônios saudáveis mostram soma intacto com fluorescência brilhante.

Usando uma micropipeta, coloque 1 mililitro de água estéril na placa de nematóides. Em seguida, agite a água para levantar os nematóides. Em seguida, remova o líquido com os nematóides para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Após 10 minutos, à medida que os nematóides se assentam por gravidade, remova cuidadosamente pelo menos 500 microlitros de água e descarte.

Em seguida, ressuspenda os nematóides e, usando uma ponta de pipeta amarela cortada, remova de 50 a 100 microlitros de vermes suspensos em cada placa de tratamento, garantindo que cada placa tenha pelo menos 10 vermes adultos. Prepare duas lâminas colocando um pedaço de fita adesiva em apenas um lado da lâmina para formar uma almofada de espessura uniforme.

Em seguida, posicione uma corrediça limpa e não utilizada entre eles na bancada. Coloque uma gota de 10 microlitros de agarose derretida no centro da lâmina usando um micropipetador. Em seguida, alise a gota colocando outra lâmina limpa na parte superior perpendicular à lâmina com a gota e aplique pressão para que a gota de agarose forme a espessura da fita de rotulagem.

Depois, aplique pressão constante para separar as duas lâminas. Em seguida, descanse a lâmina com o lado do ágar-ágar voltado para cima na bancada e deixe-a secar por um a dois minutos antes de usar. Para adicionar nematóides à lâmina preparada com a almofada de agarose, adicione uma gota de 5 microlitros de água contendo 1 molar de azida de sódio à almofada de ágar, que anestesiará os vermes e os mobilizará.

Em seguida, transfira pelo menos 10 nematóides por lâmina de tratamento para a gota usando um picador de minhoca, que deve ser esterilizado antes e depois da transferência dos nematóides. Em seguida, adicione uma lamínula usando uma pinça, colocando-a em um ângulo e abaixando-a lentamente.

Em seguida, coloque o suporte úmido preparado em um microscópio fluorescente para observar os vermes, primeiro sob ampliação de 10x e contraste de fase, depois sob ampliação de 40x com contraste de fase e iluminação fluorescente.

Coloque uma montagem úmida preparada de cada vez no microscópio stage e prenda-o no lugar usando os clipes do microscópio stage. Em seguida, comece a visualizar as montagens molhadas com a objetiva de menor ampliação, que normalmente é de 10x. e use um campo brilhante ou contraste de fase para visualizar e focar nos nematóides.

Uma vez que um nematóide esteja localizado no campo de view, concentre-se nele usando o botão de foco fino no microscópio. Em seguida, mude a iluminação para fluorescência girando o botão e direcione a luz para a câmera para capturar as imagens digitais.

Em seguida, ajuste a iluminação usando o software de imagem para que os neurônios fiquem bem iluminados, mas não supersaturados. Em algum momento, obtenha uma imagem separada de uma régua na mesma ampliação das imagens das células para fornecer uma escala de ampliação para sua figura.