Induzindo Lesão Cerebral Traumática Penetrante em Moscas Drosophila Adultas

Pegue as moscas Drosophila adultas geneticamente modificadas recém-emergidas.

Os corpos dos cogumelos no cérebro da mosca contêm neurônios que expressam proteínas fluorescentes verdes.

Os corpos dos cogumelos são estruturas que contêm redes neuronais complexas essenciais para o aprendizado e a memória.

Anestesie as moscas em uma almofada de dióxido de carbono.

Sob um microscópio estéreo equipado com os filtros necessários, visualize os corpos dos cogumelos expressando fluorescência verde.

Pegue um alfinete Minutien higienizado e empurre-o através da cápsula da cabeça para o corpo do cogumelo.

Isso causa danos aos neurônios do corpo do cogumelo e interrompe as redes neuronais, causando lesão cerebral traumática penetrante.

Em seguida, remova cuidadosamente o pino da braguilha.

Coloque as moscas feridas em um frasco com comida e deixe-as se recuperar para estudos posteriores.

Depois de anestesiar as moscas em uma almofada de dióxido de carbono, separe as moscas machos F1 recém-fechadas dentro de seis horas após a eclosão e coloque-as em frascos limpos contendo alimentos com 40 ou menos moscas por frasco. Em seguida, higienize os pinos minucienos colocando aproximadamente 100 pinos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro cheio de etanol a 70% por cinco minutos. Em seguida, higienize a almofada de dióxido de carbono no pincel borrifando etanol 70% e enxugando com um lenço de papel limpo e sem fiapos.

Quando as ferramentas estiverem limpas e secas, transfira 40 ou menos machos F1 classificados para a almofada limpa e separe-os em dois grupos. Um grupo servirá como moscas de controle não feridas, e o segundo grupo experimental será submetido a lesão cerebral traumática penetrante. Em seguida, usando uma pinça, puxe de quatro a cinco novos pinos minucianos para fora do tubo da microcentrífuga e coloque-os perto da borda da almofada de dióxido de carbono. Em seguida, sob o escopo de dissecação, escolha um alfinete minuciano reto com uma ponta afiada. Reutilize pinos afiados e coloque pinos danificados ou cegos em um tubo separado contendo 70% de etanol para descarte seguro.

Em seguida, para moscas com o genótipo cruzado padrão, ligue a lâmpada LED do estereomicroscópio equipada com os filtros de excitação e emissão apropriados para a proteína fluorescente verde, que permite excitação de 440 a 460 nanômetros e permite visualização de 500 a 560 nanômetros. Em seguida, escolha uma mosca do grupo experimental e posicione a mosca de forma que o experimentador tenha uma visão dorsal da cápsula da cabeça com a cabeça da mosca à direita. Usando uma pinça, pegue e segure o pino minuciano selecionado em uma mão e o pincel na outra. Em seguida, coloque a escova no interior do tórax dorsal e empurre suavemente para baixo para estabilizar a mosca.

Aponte a ponta do alfinete minuciano para os corpos dos cogumelos, corpos celulares no lado direito da cabeça e penetre na cápsula da cabeça. Se estiver usando pontos de referência, direcione a cutícula dorsal da cabeça entre os ocelos e a borda dorsal do olho. Depois de completar a lesão, use o pincel para empurrar a cabeça suavemente para fora do pino minuciano. Se estiver usando o cérebro para sequenciamento de RNA ou qRT-PCR, faça uma segunda lesão no lado esquerdo da cabeça. Uma vez que todas as moscas experimentais tenham sido feridas, coloque as moscas controle e feridas em frascos rotulados separados contendo alimentos.