Imunoprecipitação da cromatina nativa de células da neuroesfera

Pegue as células da neuroesfera em um tampão contendo detergentes, inibidores de cálcio e protease.

O detergente permeia as células, enquanto o inibidor inativa as proteases para preservar a proteína-alvo ligada à cromatina.

Adicione nuclease e incube. A nuclease usa cálcio para digerir a cromatina.

Adicione um tampão contendo EDTA que quelata o cálcio, inativando a nuclease.

Adicione tampão de lise para lisar as células, liberando a cromatina.

Centrifugue e colete o sobrenadante.

Adicione anticorpos específicos para a proteína alvo e incube com rotação. Centrifugue e remova o sobrenadante.

Introduza esferas magnéticas direcionadas ao anticorpo e incube com rotação.

Adicione tampão de lise para separar o DNA não especificamente ligado.

Capture magneticamente as contas e remova o sobrenadante.

Adicione um tampão com alto teor de sal para separar proteínas não especificamente ligadas.

Capture magneticamente as contas e remova o sobrenadante.

Adicione um tampão de estabilização, capture magneticamente os grânulos e remova os contaminantes.

Ressuspenda em um tampão de proteinase-K para digerir as proteínas, liberando o DNA.

Uma vez que as neuroesferas são colhidas, centrifugue 1 vezes 10 para as 6 células da neuroesfera por imunoprecipitação a 300 vezes g por 5 minutos. Após centrifugação, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento da neuroesfera em um mililitro de solução salina equilibrada. Transfira a suspensão para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas e centrifugue como antes.

Em seguida, decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 95 microlitros de tampão de digestão suplementado de 1 a 100 com coquetel de inibidores de protease por 1 vezes 10 para as 6 células. Pipete imediatamente as células para cima e para baixo para evitar aglomeração e evitar a criação de bolhas. Em seguida, misture 5 microlitros de nuclease microcócica 0,1x e 145 microlitros de tampão de digestão e adicione 5 microlitros de nuclease microcócica diluída por 1 vezes 10 às 6 células. Agite o tubo para misturar e coloque o tubo em um bloco de calor de 37 graus Celsius por exatamente 12 minutos.

A digestão da nuclease microcócica para fragmentar a cromatina é a etapa mais crítica. A fragmentação adequada da cromatina é importante para obter uma alta resolução para ChIP. Para garantir que esta etapa seja bem-sucedida, incube várias amostras, uma de cada vez, para garantir que não ocorra digestão excessiva.

Após 12 minutos, adicione 10 microlitros de 10x tampão de parada de nuclease microcócica por 1 vezes 10 às 6 células. As amostras devem ser mantidas em gelo a partir deste ponto. A análise do bioanalisador da amostra digerida pela nuclease microcócica demonstra que a maior parte do DNA foi fragmentada em mono, di e trinucleossomos. Em seguida, adicione 110 microlitros de tampão RIPA 2x suplementado 1 a 100 com coquetel inibidor de protease por 1 vezes 10 às 6 células.

Agite o tubo para misturar e centrifugue por 15 minutos a 4 graus Celsius e 1.700 vezes g. Transfira o sobrenadante que contém a cromatina para um tubo de microcentrífuga regular de 1,5 mililitro e coloque no gelo. Use tampão RIPA suplementado com inibidores de protease de 1 a 1.000 para diluir a cromatina de modo que cada IP tenha um volume de 100 a 200 microlitros. Em seguida, remova uma alíquota equivalente a 10% do volume ChIP como amostra de entrada.

Prepare a entrada adicionando 100 microlitros de tampão TE suplementado com proteinase-K e incube a 55 graus Celsius por uma hora. Depois de purificar a entrada com um kit de purificação por PCR, medir a concentração da entrada usando um espectrofotômetro de micro volume. Registre os resultados em um caderno. Adicione 10 microlitros de esferas magnéticas de proteína A e G lavadas por IP que serão realizadas em cada amostra e incube por uma hora a 4 graus Celsius com rotação a 20 RPM.

Coloque a amostra em um suporte magnético e deixe as contas se separarem. Em seguida, transfira o volume necessário para novos tubos de 1,5 mililitro. Adicione o anticorpo desejado a cada tubo e, em seguida, envolva as tampas com filme plástico de parafina para evitar a evaporação. Incube as amostras durante a noite a 4 graus Celsius com rotação como antes. No dia seguinte, gire os tubos a 2000 vezes g por 10 segundos. Em seguida, adicione 10 microlitros de grânulos a cada IP e incube por três horas a 4 graus Celsius com rotação a 20 RPM.

Em seguida, coloque as amostras em um suporte magnético e deixe as esferas magnéticas se separarem. Use uma pipeta para remover o sobrenadante. Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão RIPA com inibidores de protease a cada IP e incube a 4 graus Celsius a 20 RPM por 5 minutos. Após o período de incubação, coloque as amostras em um suporte magnético e deixe as esferas magnéticas se separarem. Use uma pipeta para remover o sobrenadante. Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão cloreto de lítio suplementado com inibidores de protease em baixa concentração a cada IP e incube a 4 graus Celsius com rotação a 20 RPM por 5 minutos.

Após o período de incubação, coloque as amostras em um suporte magnético e deixe as esferas magnéticas se separarem. Em seguida, use uma pipeta para remover o sobrenadante. Em seguida, adicione 150 microlitros de TE frio sem inibidores de protease aos grânulos e incube a 4 graus Celsius com rotação a 20 RPM por 5 minutos. Após a etapa final de lavagem, ressuspender a amostra em 100 microlitros de tampão TE suplementado com a concentração final de 0,5 miligramas por mililitro de proteinase-K e incubar a 55 graus Celsius por uma hora.