Imagem de cálcio in vivo de conjuntos neuronais nos gânglios intactos da raiz dorsal de um camundongo

Pegue um camundongo transgênico anestesiado com um gânglio da raiz dorsal exposto, ou DRG, um aglomerado de corpos celulares de neurônios sensoriais que recebem informações dos membros posteriores.

Os neurônios no DRG expressam um indicador citoplasmático de cálcio.

Usando um microscópio confocal, visualize o DRG para obter imagens da atividade coletiva de um grande número de neurônios.

Sem estimulação externa, o baixo nível de cálcio intracelular mantém os indicadores em sua conformação nativa, resultando em uma fraca fluorescência basal.

Aplique um estímulo mecânico ou térmico na pata traseira, gerando um potencial de ação nos neurônios sensoriais.

O sinal se propaga para o DRG, onde os canais de cálcio dependentes de voltagem nos neurônios se abrem, permitindo o influxo de cálcio.

Os íons de cálcio adicionais se ligam aos indicadores, induzindo uma mudança conformacional que aumenta a intensidade da fluorescência.

Observe uma fluorescência brilhante no DRG, com a intensidade correspondendo ao número de neurônios estimulados exibindo influxo de cálcio.

Coloque o mouse em uma almofada aquecida para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius. Localize o aumento lombar sentindo o osso pélvico do mouse. Em seguida, raspe as costas do mouse acima da área de aumento lombar. Usando uma tesoura, faça uma incisão retangular de três lados acima do aumento lombar e dobre a pele com uma pinça.

Use a tesoura de dissecção de mola de 13 milímetros para fazer incisões de 3 a 4 milímetros no lado direito da coluna. Use uma tesoura para cortar a pele e os músculos para os lados para expor a coluna. Em seguida, usando uma tesoura de 8 milímetros, corte o músculo e o tecido conjuntivo para limpar o processo transverso do lado direito L5 DRG.

Tente minimizar o sangramento usando algodão ou espuma de gel para absorver o sangue. Abra o processo transverso L5 do lado direito usando rongeurs Friedman-Pearson ou pinças finas fortes, tomando cuidado para não tocar no DRG. Em seguida, mova o mouse e a almofada de aquecimento para o estágio personalizado. Use fita adesiva para prender o animal e a almofada de aquecimento no lugar.

Coloque o nariz do animal no cone do nariz para anestesia contínua com isoflurano. Prenda a pata traseira direita para uma posição fora do palco para facilitar a aplicação dos estímulos. Prenda a coluna no lugar com os grampos de platina sobre a pele nas vértebras ou no osso pélvico, apenas rostral e caudal ao L5 DRG. Ajuste os grampos e a platina para tornar a superfície do DRG o mais nivelada possível.

Em seguida, coloque a platina abaixo do microscópio de modo que a objetiva fique diretamente 8 milímetros acima do DRG quando abaixada. Insira o termômetro retal. Conecte as linhas de energia à almofada de aquecimento no termômetro retal. Conecte o cone do nariz às linhas de gás isoflurano.

Use um microscópio confocal vertical com uma objetiva DIC de 10x/0,4 e o software associado para geração de imagens. Use as configurações do filtro FITC verde de excitação a 495 nanômetros, emissão a 519 nanômetros e comprimento de onda de detecção entre 500 a 580 nanômetros. Sob o microscópio, encontre a superfície do DRG. Ajuste os grampos no palco para que a superfície do DRG fique o mais nivelada possível e a área de superfície máxima seja visualizada no plano focal.

Monitore o animal durante todo o procedimento para manter a anestesia com isoflurano sem overdose. Para carregar o protocolo de varredura rápida do microscópio, use as configurações típicas de tamanho de voxel 2,496 por 2,496 por 16 mícrons, 512 por 512 pixels, pilha z de 10 fatias ópticas, 1 unidade Airy para 32 micrômetros, 1% de potência do laser de 488 nanômetros e 5 miliwatts, tempo de pixel - 1,52 microssegundos, tempo de linha - 0,91 milissegundos, tempo de quadro - 465 milissegundos, velocidade de varredura LSM de 8, varredura bidirecional, ganho do detector PMD - 650 volts e ganho digital de 1.

Faça uma varredura curta de oito ciclos do DRG clicando em Iniciar Experimento na guia Aquisição. Crie um filme fazendo uma projeção ortogonal de varreduras em uma varredura por quadro ao longo do tempo. Verifique manualmente a clareza da imagem e os artefatos de imagem, como ondas de brilho cruzando o DRG. Ajuste a posição do grampo e a espessura da seção óptica e repita esta etapa até obter um filme nítido e de alta qualidade.

Em seguida, carregue o protocolo de varredura de alta resolução do microscópio usando as configurações típicas de tamanho de voxel 1,248 por 1,248 por 14 mícrons, 1024 por 1024 pixels, pilha z de seis fatias ópticas, unidade de 1,2 Airy ou 39 micrômetros, 5% de potência do laser de 488 nanômetros e 25 miliwatts, tempo de pixel - 2,06 microssegundos, tempo de linha - 4,95 milissegundos, tempo de quadro 5,06 segundos, velocidade de varredura LSM de 6, varredura bidirecional, ganho do detector PMT a 650 volts e ganho digital de 1.

Clique no botão Iniciar Experimento na guia Aquisição para criar uma imagem de alta resolução do DRG. Carregue o protocolo de varredura rápida do microscópio e registre a atividade espontânea no DRG por 80 ciclos. Gere um filme de projeção ortogonal e verifique se a imagem é de qualidade suficiente para análise. Para aplicar estímulos, ajuste o microscópio para realizar de 15 a 20 varreduras. Aguarde a conclusão das varreduras de 1 a 5 para produzir a linha de base. Aplique o estímulo durante as varreduras 6 a 10. Espere pelo menos cinco minutos após cada estímulo antes de aplicar o próximo para evitar a dessensibilização.

Para uma prensa mecânica, segure o pinçador de algômetro com a pata entre as pás sem tocar na pata. Aperte a pata começando imediatamente após o final da varredura 5 e parando imediatamente após a varredura 10. Monitore a força de prensagem com um algômetro e certifique-se de que ela não exceda 10 g acima da força desejada.

Para estímulos térmicos, aqueça um copo de água até um pouco acima da temperatura desejada. Quando a água estiver na temperatura correta, aplique o estímulo imediatamente após a varredura 5, imergindo a lagoa na água. Puxe o copo imediatamente após a varredura 10.