Imagem de neurônios motores marcados com fluorescência em uma perna adulta de Drosophila

Comece com uma configuração de microscópio confocal contendo uma perna fixa de Drosophila geneticamente modificada montada no espaço entre duas lamínulas. Os axônios do neurônio motor na perna expressam uma proteína fluorescente marcada com membrana.

Use um único laser e dois detectores para capturar sinais fluorescentes dos axônios do neurônio motor e autofluorescência de fundo da cutícula, que é a camada mais externa da perna.

Ajuste as configurações de imagem para obter resolução e qualidade de imagem ideais.

Ajuste o brilho para garantir um sinal axonal brilhante e uma autofluorescência saturada da cutícula.

Capture uma imagem com sinal axonal e autofluorescência da cutícula.

Usando o software de processamento de imagem apropriado, abra a imagem capturada.

Divida os canais e subtraia a autofluorescência da cutícula de fundo do sinal axonal.

Ajuste o brilho e o contraste de ambos os sinais para melhorar a clareza da imagem.

Mescle os canais para gerar uma imagem mesclada para visualizar os axônios do neurônio motor dentro do segmento da perna.

Para obter imagens das pernas, use o laser de 488 nanômetros e dois detectores simultaneamente para configurar a primeira trilha para obter a GFP e a autofluorescência da cutícula. Selecione uma objetiva de imersão em óleo de 20 a 25x e defina a resolução para 1024 por 1024 pixels, com uma profundidade de 12 bits. E defina o espaçamento z para 1 micrômetro. Carregue a lâmina na platina do microscópio.

E usando a mesma potência de laser para ambos os detectores, ajuste o ganho do primeiro detector para obter um sinal GFP brilhante. E ajuste o segundo detector para garantir que algumas áreas com alto sinal de cutícula produzam um sinal saturado neste detector. Em seguida, crie uma imagem das pernas, usando as opções de bloco ou posição para capturar a perna inteira, se uma perna estiver estendida ou muito grande para ser fotografada em um único quadro.

Para processamento de imagem, abra a pilha confocal no ImageJ Fiji. E use o plug-in de formatos para abrir todas as imagens que não estejam no formato TIFF. Para dividir os canais, selecione Imagem, Cor e Dividir canais. Para subtrair o sinal de cutícula do sinal GFP, abra a Calculadora de Processo e Imagem e selecione a pilha do detector um como Imagem1.

Na janela de operação, selecione Subtrair e selecione a trilha do Detector 2 como Imagem2, para que apenas o sinal GFP endógeno seja obtido. Use Image, Stacks, Z Protect para gerar projeção de intensidade máxima para o sinal GFP endógeno. Use os controles na janela de controle de brilho para ajustar o brilho e o contraste.