Microscopia de dois fótons para imagem da morfologia neuronal em um filhote de camundongo

Comece configurando a luz de excitação para o microscópio de dois fótons.

Pegue um filhote de camundongo transgênico anestesiado com uma janela circular de imagem de vidro e uma placa de cabeça implantada em seu crânio.

Os neurônios expressam proteínas fluorescentes vermelhas para facilitar a imagem.

Limpe a janela de imagem de vidro e prenda o filhote no estágio de imagem de dois fótons.

Alinhe a janela de imagem com a objetiva do microscópio ajustando a cabeça do filhote.

Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do filhote.

Ajuste a taxa de fluxo anestésico.

Aplique uma gota de água na lamínula e, em seguida, abaixe a lente objetiva do microscópio.

A microscopia de dois fótons usa dois fótons de luz para ativar proteínas fluorescentes, permitindo imagens neuronais detalhadas com ruído de fundo e fotobranqueamento mínimos.

Capture imagens dos neurônios em várias profundidades para visualizar sua estrutura

Por fim, empilhe as imagens para gerar uma representação tridimensional do neurônio, incluindo suas projeções neuronais, para estudar as mudanças morfológicas relacionadas ao crescimento.

Para começar a criar imagens, primeiro defina o comprimento de onda do laser de dois fótons. Para excitação de RFP, use um comprimento de onda de 1.000 nanômetros. Limpe a superfície da lamínula com etanol a 70%. Prenda o filhote anestesiado à placa de titânio no estágio de imagem usando a barra de titânio. Use o estágio do goniômetro para ajustar a cabeça de forma que a lamínula fique paralela à lente objetiva.

Mantenha a temperatura corporal do filhote durante a imagem, usando uma almofada de aquecimento ajustada para 37 graus Celsius, e reduza a concentração de isoflurano para 0,7% a 1%. Coloque o estágio de imagem sob a lente objetiva de 20X do microscópio de dois fótons. Aplique uma gota de água na lamínula.

Configure o software para adquirir imagens de pilha z em intervalos de 1,4 mícron. Para imagens de neurônios da camada quatro, defina a largura z entre 150 e 300 mícrons para obter imagens de toda a morfologia dendrítica. Use varredura lenta e média para obter imagens nítidas mostrando a morfologia neuronal.

Geralmente, leva mais de 20 minutos para adquirir toda a morfologia dendrítica.