Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio

O objetivo geral deste procedimento é remover o coração do peixe-zebra. Isso é feito primeiro coletando e fixando o peixe-zebra. Em seguida, a cavidade do corpo é aberta para visualizar o coração.

Em seguida, o coração é removido e limpo de tecido não cardíaco. Finalmente, o coração é fotografado. Em última análise, a morfologia do coração ao longo do tempo pode ser vista por meio de microscopia, seccionamento e fotografia.

A demonstração visual deste método é crítica como a chave para a dissecação. Sta são difíceis de aprender porque o peixe-zebra é pequeno e os tecidos não são distintos em cor e podem ser difíceis de identificar Para gerar peixe-zebra a partir das larvas até os estágios adultos. Para esses experimentos, realize acasalamentos individuais de pêra ou em grupo com peixes adultos.

Limpe os embriões e armazene-os em uma incubadora a 28 graus Celsius. Cinco dias após a fertilização, separe os peixes em tanques com uma densidade de 10 a 15 peixes e coloque-os nas instalações para peixes. Retire o peixe do tanque na idade apropriada e coloque-o em 0,2% Trica para anestesiar.

Coloque o peixe anestesiado em água gelada por 15 minutos para sacrificar. Enquanto isso, adicione 4% de formaldeído ou PFA em um XPBS a um prato. Incubar os peixes coletados no 4% PFA por uma a duas horas em temperatura ambiente e, em seguida, durante a noite a quatro graus Celsius em uma placa de Petri envolta em perfil.

Isso mantém o peixe plano e torna a dissecação muito mais fácil após a fixação. Enxágüe duas vezes em PBS com 0,1% Tween ou PBT, os peixes podem ser mantidos em PBT a quatro graus Celsius por até 10 dias. Coloque um único peixe em uma placa de Petri, meio cheia de PBS fresco e coloque-o do lado direito.

Meça o comprimento do peixe do focinho até a base da cauda, sem incluir as barbatanas da cauda usando um paquímetro milimétrico digital. Este é o comprimento padrão ou sl. Atribua a cada peixe uma combinação de letras numéricas para permitir que um peixe individual e o coração dissecado resultante sejam rastreados para análise posterior.

Insira todos os dados, incluindo todas as medições em uma planilha e organizados com base nesses rótulos antes da dissecação. Rotule as tiras de tubos de PCR com o número de rastreamento atribuído e encha os tubos com PVT ou outra solução apropriada para análise posterior. Oriente o local ventral do peixe em uma placa de Petri enquanto estabiliza o corpo com uma pinça, segurando a cabeça entre os olhos e as guelras para peixes com menos de 12 milímetros de comprimento padrão.

Usando uma pinça afiada ou uma microagulha em um porta-pinos. Remova os músculos peitorais e as barbatanas do corpo para revelar o coração. O movimento constante da pinça durante a dissecção pode causar correntes no PPT que movem o peixe.

Isso é particularmente problemático para peixes menores. Assim, uma microagulha precisa ser usada para remover os músculos peitorais e a barbatana e abrir a cavidade corporal. Use a pinça para retirar suavemente o coração da cavidade sob o átrio.

Se o peixe contiver um marcador cardíaco fluorescente, use um escopo fluorescente para a dissecção e verifique a remoção do coração por fluorescência. Depois que o coração for removido da cavidade, use a pinça para segurar o coração e uma microagulha para remover o tecido não cardíaco extra e o revestimento epicárdico do lado de fora do coração. Para peixes com mais de 12 milímetros de comprimento padrão.

Usando uma microtesoura com cabo de mola, faça três incisões. Primeiro, faça um corte transversal nas brânquias. Em segundo lugar, faça outro corte transversal na barriga anterior.

E terceiro, faça um corte sagital no lado ventral conectando os dois cortes transversais. Usando uma pinça afiada, remova os músculos peitorais e as barbatanas do corpo para abrir a cavidade corporal e revelar o tecido prateado do pericárdio. Remova esse tecido pericárdico e o coração ficará visível.

Use a microtesoura para cortar a artéria conectada à arteriose do bulbo localizada acima do coração. Uma vez que esta artéria é cortada, coloque as pontas da pinça sob o átrio e use a pinça para retirar o coração da cavidade. Se houver tecido extra que vem com o coração, tudo bem, pois pode ser removido mais tarde.

Alternativamente, em alguns peixes, é possível remover o coração puxando suavemente o bulbo para fora e o resto do coração seguirá. Tenha cuidado com a localização do átrio se estiver usando a técnica alternativa, pois ele pode ser facilmente danificado. Se houver tecido extra que vem com o coração, isso é bom e pode ser limpo depois.

Uma vez que o coração é removido da cavidade, use as duas pinças para segurar o coração e remova o tecido extra ou um par de pinças para segurar o coração e uma microagulha para remover o tecido não cardíaco extra. Para fotografar o coração do peixe-zebra, prepare uma placa de ágar de 23 gramas por litro de ágar nutriente e cubra o ágar solidificado com PBS. Use a pinça para fazer um poço no ágar que permita que o coração se encaixe na orientação correta.

Remova o coração do tubo de PCR segurando a ponta do bulbo. Com a pinça firmemente. Coloque o coração no prato de ágar.

Oriente o coração no ágar para fotografar. A amostra pode ser girada após cada imagem para todas as orientações possíveis. Use sobrecarga, luz e tempos de exposição curtos para fotografar os corações.

Faça ajustes para a qualidade da luz usando a exposição conforme necessário para obter a melhor fotografia. Um exemplo de um coração limpo bem dissecado é mostrado aqui. Cada coração terá algumas diferenças na morfologia geral, mas o coração deve estar completo contendo um átrio ventrículo intacto e arteriose bulbosa após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do desenvolvimento cardíaco do peixe-zebra explorarem a maturação cardíaca em vários estágios do desenvolvimento do peixe-zebra.