Injeção estereotáxica de vetores virais para reprogramação de células gliais em modelo de camundongo

Prenda um camundongo transgênico anestesiado em uma estrutura estereotáxica com o crânio exposto.

Este camundongo expressa Cre recombinase em células gliais.

Posicione o braço estereotáxico segurando o tubo capilar sobre o crânio e alinhe-o acima do bregma.

Ajuste os eixos estereotáxicos para uma segmentação precisa.

Faça um furo no local alvo, garantindo que a dura-máter permaneça intacta. Remova fragmentos ósseos.

Lave o tubo capilar com tampão. Desenhe uma bolha de ar e, em seguida, carregue o vírus adeno-associado que carrega genes de reprogramação neuronal inativa e proteína fluorescente.

Abaixe o tubo capilar até a profundidade alvo e injete a solução viral na região rica em células gliais.

Retraia cuidadosamente o tubo para evitar o refluxo.

Feche a incisão e permita a recuperação.

Os vírus internalizados entregam genes inativados flanqueados por loxP ao núcleo glial. A cre recombinase os inverte, ativando genes de reprogramação neuronal e impulsionando a conversão neuronal. Os interneurônios reprogramados expressam a proteína fluorescente sob o promotor específico do neurônio.

Para injetar fatores de reprogramação, coloque um camundongo anestesiado na estrutura estereotáxica, administre analgesia apropriada no início da cirurgia e, em seguida, traga a ponta do capilar de vidro da agulha de injeção logo acima do bregma. Certifique-se de que a ponta capilar esteja perfeitamente reta nos planos AP e ML. Redefina os valores ML e AP para 0,0 no contador de coordenadas digital.

Para garantir que a cabeça do animal esteja em uma posição perfeitamente plana, use o contador de coordenadas digital para medir o valor da coordenada DV quando o braço AP estiver em mais 2,0 e menos 2,0, bem como quando o braço ML estiver em mais 2,0 e menos 2,0. Ajuste a altura da barra de dente e das barras auriculares de acordo. Depois, levante ligeiramente a seringa e faça um furo usando uma broca dentária nas coordenadas da injeção.

Comece a perfurar no local, trabalhando de forma circular e suave. Em seguida, coloque um pedaço de gaze de algodão sobre a incisão aberta e lave a seringa com solução salina. Após a lavagem, retire uma bolha de ar e, em seguida, 1 microlitro de solução contendo o vetor viral. Certifique-se de que a solução viral possa ser facilmente visualizada abaixo da bolha de ar.

Em seguida, abaixe a seringa, progredindo lentamente até a profundidade desejada e certifique-se de que a trajetória esteja livre de fragmentos ósseos. Posteriormente, injete 1 microlitro da solução viral a uma taxa de 0,4 microlitros por minuto. Quando a injeção estiver concluída, aguarde dois minutos para a difusão antes da retirada da seringa.

Após a difusão, retraia lentamente a seringa até que a ponta do capilar seja completamente retirada do cérebro. Em seguida, suture cuidadosamente a incisão e remova o animal da estrutura estereotáxica. Monitore o animal em uma estação pós-operatória até que a consciência seja recuperada.

Os animais são mantidos por até 12 semanas após a injeção do vírus para permitir que a glia residente se reprograme em neurônios maduros.