Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar de forma não invasiva a dinâmica da hipóxia tumoral em metástases cerebrais ortotópicas de câncer de mama em um modelo de camundongo. Isso é conseguido transduzindo de forma estável as células MDA MB 2 31 do câncer de mama com a construção repórter de hipóxia. Em seguida, ensaios de luciferase in vitro são usados para garantir a transfecção e expressão bem-sucedidas da construção repórter de hipóxia.

Em seguida, a imagem de bioluminescência in vivo é realizada para monitorar as alterações longitudinais na hipóxia tumoral das metástases intracranianas. Os resultados mostram o início e a evolução da hipóxia tumoral de metástases cerebrais de câncer de mama com base em imagens de bioluminescência do padrão de expressão do gene repórter de hipóxia. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o eletrodo de oxigênio EOL, é que esta matéria é totalmente não invasiva e permite o monitoramento invasivo da mudança dinâmica longitudinalmente.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de tumores cerebrais porque a hipóxia tumoral reduz a eficácia da terapia convencional, como a radiação. Portanto, detectar a extensão da hipóxia tumoral será útil no planejamento de intervenções terapêuticas. Primeira cultura, as células de luciferase MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D, que são uma linha celular de câncer de mama metastático humano transfectada de forma estável com um novo gene reporto dependente de HIF um alfa em meio DMEM suplementado para a placa de ensaio de bioluminescência alfa HIF in vitro três vezes 10 para as cinco células de luciferase MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D em cada poço de duas placas de seis poços incubam as células durante a noite em um incubadora de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que as células se fixem ao prato.

No dia seguinte. Coloque uma das seis placas de poço na câmara de hipóxia, junto com um prato contendo 10 a 20 mililitros de água estéril para evitar a aberração de EVA das culturas. A segunda placa permanece na incubadora de cultura de tecidos a 21% de oxigênio e serve como controle de normóxia.

Conecte a tubulação da porta de entrada a um cilindro de gás contendo 0.1% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 94.9% de nitrogênio. Abra as braçadeiras da porta de entrada e de perspectiva e aplique gás na câmara de hipóxia para atingir uma concentração de oxigênio de 0,1%. Desconecte a fonte de gás e sele a câmara fechando o plástico clamps.

Em seguida, coloque a câmara na incubadora de cultura de tecidos por 24 horas. Após 24 horas, realize o ensaio de bioluminescência primeiro, aspire o meio de ambas as placas de seis poços e lave rapidamente as células duas vezes com PBS gelado. Em seguida, adicione um mililitro, PBS frio revisado contendo 100 microlitros de Lúcifer em imagens adquiridas por luminescência, usando o paquímetro Enogen spectrum com tempos de exposição de 1, 30, 60 e 180 segundos.

E meça a intensidade da bioluminescência em cada poço usando software de imagem viva no dia da injeção intracraniana, colha as células de luciferase MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D a 80% de confluência por tripsina e centrifugação. Suspenda novamente o pellet em fresco, médio e faça uma contagem de células. Dilua a suspensão celular até uma concentração final de 10 a cinco células em um volume de quatro microlitros e coloque as células ressuspensas no gelo após a anestesia.

Camundongos nus fêmeas de quatro a seis semanas de idade com 3% de gelo de flúor misturado com oxigênio. Em uma câmara de indução, transfira o animal para um cone nasal administrando 2% de flúor para manter a anestesia, esterilize o couro cabeludo limpando com solução de Betadine e depois álcool a 70%. Em seguida, usando um bisturi afiado, faça uma incisão na linha média e exponha o hemisfério direito do crânio.

Identifique o ponto que é um milímetro anterior à sutura coronal e dois milímetros laterais à sutura sagital. Use uma broca de alta velocidade para fazer um furo de um milímetro. Neste ponto, coloque os quatro microlitros de suspensão celular em uma seringa Hamilton de 10 microlitros.

Equipado com uma agulha Hamilton de calibre 32. Posicione a seringa Hamilton sobre o orifício no crânio. Insira cuidadosamente a ponta da agulha um milímetro abaixo da URA mater.

Quando essa profundidade for atingida, pressione cuidadosamente o êmbolo da seringa para injetar as células diretamente no corredor direito. D kelon. Depois de injetadas as células, aguarde cerca de 30 segundos e, em seguida, retire cuidadosamente a agulha.

Preencha o orifício da broca com osso, feche o couro cabeludo com suturas absorvíveis e esterilize a região com álcool 70%. Administre a primeira injeção de buprenorfina para analgesia. A analgesia com buprenorfina é administrada a cada 12 horas durante dois dias.

Certifique-se de que o animal se recuperou totalmente do anestésico. Em seguida, volte para a gaiola inicial. Duas semanas após o implante intracraniano das células, iniciar a bioluminescência longitudinal usando o sistema de espectro ivus.

Depois de anestesiar simultaneamente três camundongos com 3% de isof, flúor e oxigênio. Administre uma solução de 120 miligramas por quilograma de Lúcifer em um volume total de 80 microlitros na nuca. Imediatamente após a administração da injeção, defina um cronômetro para cinco minutos.

Coloque os camundongos na câmara de imagem e mantenha a anestesia com 1% de isof, flúor e oxigênio a uma taxa de fluxo de um decímetro cúbico por minuto. Após cinco minutos terem decorrido a partir do momento da injeção luciferiana. Adquira imagens de bioluminescência com tempos de exposição de 1, 30, 60 e 180 segundos.

Depois de capturar a imagem final, remova os animais da câmara e coloque-os de volta na gaiola doméstica para permitir que eles se recuperem da anestesia. Analise os dados usando o software de imagem viva, desenhe manualmente uma região de interesse para delinear o sinal de bioluminescência e, em seguida, use contagens absolutas de fótons por segundo para quantificar a intensidade do sinal. Repita a imagem de bioluminescência uma vez por semana durante oito a 10 semanas.

Então, imediatamente após a última sessão de imagem de bioluminescência, administre piol o marcador de hipóxia e sacrifique os camundongos. Uma hora depois, após remover todo o cérebro embutido no meio de temperatura de corte ideal e congelar o freezer de 80 graus Celsius negativos. Coloração histológica subsequente da crista violeta e coloração imuno-histoquímica contra hipóxia de luciferase.

Marcador OLE e H um alfa é realizado para validar as observações de imagem. Esta imagem mostra resultados representativos do ensaio de bioluminescência alfa HIF one in vitro. A barra de escala à direita é exibida de baixo para cima.

A pseudo cor muda associada ao aumento da bioluminescência. Os dois poços superiores de células de Lúcifer HEDD MDAM 2 3 1 5 foram mantidos em condições hipóxicas. De acordo com o procedimento descrito neste artigo em vídeo, a cor verde indica aumento da transcrição do repórter de luciferase do promotor HIF um alfa em resposta a condições hipóxicas.

Os dois poços inferiores são poços de controle mantidos sob normóxia e emitiram apenas níveis muito baixos de bioluminescência. Esta imagem mostra os resultados da imagem longitudinal in vivo de bioluminescência da dinâmica da hipóxia tumoral. O mesmo animal foi fotografado uma vez por semana de cinco a 10 semanas após a administração intracraniana de células de luciferase M-D-A-M-B 2 31 5 H-R-E-O-D-D.

Um sinal de luz fraco do lado direito do cérebro do camundongo foi visualizado pela primeira vez. Cinco semanas após o implante intracraniano das células de câncer de mama, foi observado um aumento do sinal óptico ao longo de seis semanas adicionais, indicando aumento da hipóxia tumoral. Este gráfico mostra a curva de curso de tempo da contagem quantitativa de fótons do sinal de luz ao longo das seis semanas de imagem.

Esta imagem mostra uma seção de 10 mícrons de um cérebro de camundongo congelado com uma metástase de imunocoloração de câncer de mama com o marcador hipóxico pi Monossol al heterogeneidade intratumoral de hipóxia é aparente aqui, a mesma seção que imunocoloração com anticorpo anti luciferase. Esta imagem de sobreposição mostra que a heterogeneidade intratumoral da hipóxia se correlaciona espacialmente com a expressão de lúcifer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar imagens de bioluminescência para monitorar a dinâmica da hipóxia do tumor intracraniano com base na aparência do gene HRE relatado pela hipóxia.