Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

O objetivo geral deste procedimento é inibir ou derrubar a expressão de uma proteína específica na retina do peixe-zebra adulto. Isso é feito removendo primeiro a córnea externa do olho de peixe. Em seguida, um pequeno orifício é criado na córnea interna do olho.

Em seguida, o morfo específico do gene é injetado no vítreo. Finalmente, o morfo é eletroporado nas células da retina. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram expressão reduzida da proteína-alvo por meio de microscopia de imunofluorescência de seções de tecido da retina ou immunoblotting.

As implicações desta técnica se estendem à terapia de doenças degenerativas da retina, como retinite pigmentosa. Devido ao potencial de elucidar os mecanismos subjacentes da proliferação de células gliais de Mueller na retina danificada, podemos encontrar maneiras de induzir uma resposta semelhante no dano à retina humana. Embora esse método possa fornecer informações sobre a regeneração da retina na retina do peixe-zebra adulto, ele pode ser ligeiramente modificado para fornecer informações em outros processos na retina, como o papel de proteínas específicas na fototransdução ou no processamento visual.

Demonstrando o procedimento que foi desenvolvido pelo Dr. Ryan Tummel enquanto ele era um pós-doutorado. No meu laboratório estará o Dr. Travis Bailey, um pós-doutorado atual em meu laboratório. Antes de trabalhar com peixes, prepare morfos marcados com lissamina carregada positivamente que podem ser eletroporados em células diluindo 300 NMO de Morpho em 100 microlitros de água-azul-petróleo livre de nuclease para solução de três milimolares.

Para remover a camada externa da córnea, anestesiar o peixe-zebra de seis a 12 meses em um miligrama por mililitro de trica ou dois feth etanol em tanque de peixe-zebra embrulhar o peixe-zebra em um pedaço umedecido de papel toalha cobrindo as brânquias, mas deixando o olho exposto. Coloque o peixe embrulhado sob um estereoscópio e aumente a ampliação até que o diâmetro do olho preencha aproximadamente um terço do campo visual. Em seguida, usando a pinça número cinco de Dumont, pegue a córnea externa perto da fissura óptica no local de uma leve saliência ou lábio para evitar que o olho se desloque.

Ao remover a córnea, estabilize-a com outro conjunto de pinças. Em seguida, puxe em um ângulo baixo pelo olho para remover a córnea. Imediatamente após a remoção da córnea externa, use um bisturi de lâmina de safira para fazer uma pequena incisão na córnea onde a pupila encontra a carga da íris.

Aponte cinco microlitros da solução morpho em uma seringa Hamilton equipada com uma agulha de ponta romba removível de calibre 33. Canalize-o para cima e para baixo para remover o airable na linha. Insira cuidadosamente a agulha no vítreo através da incisão.

Não insira a agulha muito longe para evitar perfurar a retina ou deslocar a lente. Injete lentamente a solução morpho no espaço do vitríolo. O vítreo incolor vazará da incisão à medida que for deslocado pela solução morfológica.

Injete até que uma pequena quantidade de morpho vaze da incisão. O morino marcado com lissamina deve ser claramente visível dentro do olho. Após a injeção, retorne o peixe ao tanque para se recuperar usando o outro olho como um controle injetado unin, defina os parâmetros de eletroporação para dois pulsos consecutivos de 50 milissegundos a 75 volts.

Com uma pausa de um segundo entre os pulsos após a injeção de aproximadamente 10 peixes. Reanestesiar um peixe injetado e embrulhá-lo em um pedaço de papel umedecido. Toalha apenas cobrindo as guelras, mas deixando o olho exposto.

Transfira o peixe para uma placa de Petri cheia de anestesia. Com as mãos enluvadas, segure suavemente o peixe no fundo do prato cheio de anestesia, tomando cuidado para submergir completamente o olho. Para atingir a retina dorsal, pressione suavemente o eletrodo positivo para baixo na metade ventral do olho, fazendo com que o olho gire e exponha a porção dorsal do globo ocular enquanto ainda pressiona o lado ventral, coloque o eletrodo negativo a 0,5 a um milímetro de distância da metade dorsal exposta do olho.

Evite colocar o eletrodo negativo diretamente no olho, pois isso danificará a retina dorsal. Depois de determinar a distância apropriada entre os eletrodos, ajuste o parafuso na alça dos eletrodos para manter uma propagação constante para eletroporação subsequente. Eletroporou o olho e devolveu o peixe a um tanque com água fresca do tanque para reviver imediatamente submete o peixe a um procedimento que causa alterações na expressão gênica da retina, como degeneração retiniana induzida por luz constante.

Quando as retinas são seccionadas de nasal para temporal no eixo ventral dorsal, as caixas azuis sombreadas representam as áreas da retina que são mais frequentemente danificadas pelo próprio evento de eletroporação. A caixa rosa sombreada representa a área que é alvo da introdução de morfo nas células da retina pela eletroporação. Como mostrado aqui na imagem à direita três dias após a eletroporação, o marcador de lissamina ainda é visualizado em todas as camadas e tipos de células em uma retina seccionada, incluindo os segmentos externos dos bastonetes, a camada nuclear externa, a camada interclear e a camada de células ganglionares.

A imagem em branco à esquerda é do olho injetado unin, sem qualquer morino marcado com lissamina, o knockdown completo da proteína pode ser alcançado em três a cinco dias após a eletroporação, dependendo da eficácia do morfo. Neste exemplo, um morfo de controle negativo ou morfo A-P-C-N-A foi eletroporado em retinas, e as retinas foram removidas após um, dois ou três dias de exposição à luz, o tecido foi então processado e imunomarcado com anticorpos anti-PCNA. Muitas células PC NA positivas verdes foram observadas em todas as três retinas de controle, mas a expressão de PCNA foi significativamente reduzida nas retinas de morfina.

Depois de dominar essa técnica, você poderá realizar o procedimento em cerca de 20 peixes em uma hora. Ao tentar fazer este procedimento, é importante lembrar de não tocar os eletrodos diretamente no olho do peixe após este procedimento. Outros métodos, como imuno-histoquímica, hibridização in situ, PCR em tempo real e immunoblotting, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como quais vias genéticas são necessárias na regeneração da retina.