Investigando inflamação intestinal em DSS-induzida Modelo de IBD

Modelos experimentais de doença inflamatória intestinal nos permitiram analisar a complexa inata e adaptativa respostas imunes associadas com a patogênese. Usando pontuação histológico, quantificação de citocinas pró-inflamatórias e atividade da mieloperoxidase, pode-se começar a avaliar essas respostas visto na doença inflamatória intestinal.

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a resposta imune intestinal induzida pelo dextron sulfato de sódio, determinando as quantidades de atividade da mielo peroxidase e citocinas pró-inflamatórias produzidas em resposta à inflamação. Primeiro, a colite DSS é induzida em camundongos através da introdução da solução DSS SALT na água potável. Em seguida, a gravidade da colite é avaliada por pontuação macroscópica e o cólon é removido para análise posterior.

O cólon dissecado é então seccionado em três partes para histologia, quantificação de citocinas e atividade de NPO. Finalmente, o tecido do cólon é homogeneizado e o sobrenadante é usado para determinar a atividade da MPO. Em última análise, as mudanças na atividade da MPO podem ser determinadas por meio dos dados de absorbância coletados usando um espectrofotômetro.

Este método pode fornecer informações crônicas de vários modelos de doença inflamatória intestinal, como colite induzida por DSS e TNBS. Além disso, você pode usar este método em outros órgãos, como pulmão e fígado Antes de iniciar o procedimento. Substitua a água potável em cada gaiola de camundongo por solução DSS para induzir a inflamação.

Dê água potável em autoclave para ratos de controle sem DSS. Então, no dia do experimento, disseque o cólon, conforme demonstrado anteriormente no artigo JoVE de Whitham Williams e Williams. Esprema cuidadosamente as fezes de todo o cólon usando uma pinça dobrada, coletando-as em um papel de pesagem enxaguando o tecido com PBS estéril.

Avalie as fezes usando um par de fórceps para pressionar as fezes para determinar sua consistência para determinar uma pontuação de sangue nas fezes. Observe a cor das fezes e valide ainda mais a avaliação usando um teste hemoccult, que envolve espalhar fezes em papel hemoccult, adicionar revelador e, em seguida, anotar a cor azul denota um teste de fezes positivo para sangue. Em seguida, use esta tabela para determinar um valor para cada uma das condições.

Em seguida, mantendo a orientação proximal a distal do cólon, corte o cólon em três seções iguais. Em seguida, pegue fragmentos de amostra das seções do cólon proximal e médio do cólon e coloque as amostras em tubos individuais de 1,5 mililitro eph. Para avaliar o dano histológico da gravidade da colite, use a seção de tecido mais distal do cólon e corte um pequeno fragmento de meio a um centímetro de comprimento.

Coloque o fragmento em um de tecido e mergulhe o em solução tamponada de formalina a 10%. Em seguida, depois de preparar seções transversais embebidas em parafina dos fragmentos de tecido, corar as seções com hematina eoin para pontuação por um observador cego. Finalmente, congele as amostras das seções proximal e média do colão em nitrogênio líquido e armazene-as até o uso a 70 graus Celsius negativos.

Depois de remover as amostras de cólon do armazenamento de 70 graus Celsius negativos, coloque-as no gelo. Em seguida, use uma pinça dobrada para remover quaisquer fezes ou gordura visível e coloque-as em tubos individuais de dois mililitros adequados para uso em um homogeneizador. Em seguida, determine e registre o peso de cada amostra.

Em seguida, adicione grânulos homogeneizadores a cada tubo de amostra e, em seguida, adicione a quantidade apropriada de tampão H ao tubo de acordo com o peso do tecido conforme determinado, dissocie os fragmentos com um homogeneizador de tecido por quatro minutos a 30 hertz. Finalmente, centrifugue a solução celular por seis minutos a 13.400 vezes G e quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante num tubo novo e, em seguida, certificando-se de que mantém o grânulo de homogeneização, elimine o sedimento resultante.

O sobrenadante pode então ser armazenado a menos 70 até ser usado. Comece esta etapa adicionando sete microlitros do homogeneizado de tecido previamente preparado em triplicado em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione 50 microlitros de peróxido de hidrogênio diluído ao iodo OD Dion recém-preparado.

Usando uma pipeta multicanal, adicione 200 microlitros da mistura de peróxido de hidrogênio a cada um dos poços. Agora, meça a absorbância de 550 nanômetros usando um espectrofotômetro, fazendo três leituras em intervalos de 32. Em seguida, usando os dados de absorbância, peso do tecido e volume do tampão, calcule a atividade NPO nos homogeneizados conforme demonstrado neste cálculo de amostra.

Durante a duração do tratamento com SDS, o índice de atividade da doença pode ser usado para avaliar e avaliar a progressão clínica da doença. Os animais tratados com DSS apresentam perda de peso significativa em comparação com seus pesos iniciais, fezes moles e sangramento fecal. Quanto mais substancial do que os sistemas macroscópicos, maior o índice de atividade da doença.

Após o sacrifício e exame dos cólons de camundongos que receberam 5% de DSS na água potável por cinco dias, a gravidade da colite com base na pontuação macroscópica do encurtamento do comprimento do cólon, sangramento colônico, sangramento fecal, afrouxamento da consistência das fezes e sinais de sangramento retal para este experimento representativo foi determinada como cerca de cinco vezes pior do que em controles tratados apenas com água, conforme demonstrado por esses cortes transversais de dados de DSS tratados Amostras de tecido colônico, o mesmo com H e E, têm pontuações histológicas mais altas do que os controles tratados com água. Aqui, a arquitetura normal e a falta de infiltrado celular podem ser observadas na área indicada pelo asterisco nesta seção transversal corada com h e e coletada de um animal controle que recebeu apenas água. Agora compare esta coloração h e e de uma amostra de um animal tratado com DSS com a figura anterior.

O cólon deste animal exibe mais danos histológicos, como evidenciado por mais infiltração celular, conforme indicado pelo sinal de libra e por mais depleção de células caliciformes e maior distorção. Danos à arquitetura da cripta K, conforme indicado pelo asterisco. Para caracterizar ainda mais a extensão da gravidade da doença em camundongos tratados com DSS, a atividade NPO, um marcador substituto para inflamação, pode ser avaliada a partir de amostras de tecido do cólon homogeneizado.

Como esperado, os cólons tratados com DSS têm uma atividade NPO maior do que os controles. Além disso, a gravidade da colite induzida por SDS está associada ao aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, como IL um beta IL seis e TNF alfa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a atividade da MPO pode diminuir com o tempo.

Portanto, o ensaio MPO deve ser um dos primeiros ensaios realizados para determinar a gravidade da inflamação intestinal.