Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

O objetivo geral deste procedimento é separar fragmentos de DNA de tamanhos variados. Isso é feito preparando primeiro um gel com a concentração apropriada de aros e um corante fluorescente. O segundo passo é despejar o gel em um molde apropriado e deixá-lo endurecer em seguida.

As amostras são carregadas no gel e uma corrente é aplicada. A etapa final é visualizar os fragmentos de DNA separados sob luz ultravioleta. Em resumo, a eletroforese em gel AGROS é usada em todas as situações em que a separação rotineira de fragmentos de DNA é necessária.

A principal vantagem dessa técnica sobre o método existente na época, como a centrificação do gradiente de densidade de sacarose, é que ela fornece visualização de bandas de DNA e também nos permite determinar o sinal exato do tamanho exato do fragmento de DNA quando separado simultaneamente com um marcador de DNA. Este método é essencial na pesquisa em ciências da vida, como na clonagem de genes e na purificação e sequenciamento de moléculas de DNA. Embora esse método seja geralmente usado para separar fragmentos de DNA entre cem pares de bases e bases de 25 quilos, ele também pode ser modificado para separar fragmentos de DNA de até 10 megabases de tamanho.

Os géis Agros são preparados usando uma solução de porcentagem de peso sobre volume. A concentração de aros e um gel dependerá dos tamanhos dos fragmentos de DNA a serem separados. Para iniciar o procedimento de fazer um gel pesar a massa apropriada de aros em um erlenmeyer, adicione o volume apropriado de tampão de corrida ao balão.

O volume do tampão não deve ser superior a um terço da capacidade do redemoinho do frasco para misturar, derreta a mistura tampão aros aquecendo em microondas na potência máxima. Em intervalos 32, remova o frasco e agite o conteúdo para misturar. Bem, repita até que o agros esteja completamente dissolvido.

Em seguida, adicione brometo de atherium a uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro. É importante observar que o brometo de atherio é cancerígeno, portanto, luvas devem sempre ser usadas ao manusear géis contendo brometo de atherio para permitir que o agros esfrie por incubação em banho-maria a 65 graus Celsius. Não fazer isso irá deformar a bandeja de gel enquanto o aros está esfriando.

Prepare o molde de gel colocando a bandeja de gel no aparelho de fundição. Alternativamente, pode-se colar as bordas abertas de uma bandeja de gel para criar um molde. Coloque um pente apropriado no molde de gel para criar os poços.

Despeje o molde e aros no molde de gel. Deixe o aros endurecer em temperatura ambiente. Assim que o aros estiver definido, remova o pente.

Se o gel não for usado imediatamente, embrulhe-o em filme plástico e guarde-o a quatro graus Celsius até o uso. Se o gel for usado imediatamente, coloque-o na caixa de gel. Para iniciar este procedimento, adicione corante de carregamento de gel às amostras de DNA a serem separadas.

O corante de carregamento é normalmente feito em um programa de concentração de seis x, a fonte de alimentação para a tensão desejada agora adiciona buffer de corrida suficiente na caixa de gel para cobrir a superfície do gel. É importante usar o mesmo buffer de corrida usado para preparar o gel, conectar os fios da caixa de gel à fonte de alimentação e ligar a fonte de alimentação. Verifique se a caixa de gel e a fonte de alimentação estão funcionando.

O aparecimento de bolhas nos eletrodos indica que a corrente está passando. Como nossas mãos tendem a tremer um pouco naturalmente, pode ser difícil colocar a ponta de um pequeno cano em um pequeno poço. Uma maneira de evitar que nossa mão trema é apoiá-la no outro braço ou na caixa de gel.

Remova a tampa da caixa de gel lenta e cuidadosamente Carregue as amostras de DNA no gel. O corante de carregamento na amostra permite que a amostra afunde no gel e ajudará a rastrear a distância percorrida pela amostra. Um marcador de tamanho de DNA deve sempre ser carregado junto com as amostras experimentais.

Recoloque a tampa. Verifique novamente se os eletrodos estão conectados nos slots corretos na fonte de alimentação. Ligue a energia, execute o gel até que o corante migre para uma distância adequada.

Quando a eletroforese estiver concluída, desligue a fonte de alimentação e remova a tampa da caixa de gel. Remova o gel da caixa de gel e escorra o excesso de tampão na superfície do gel. Coloque a bandeja de gel em toalhas de papel para absorver qualquer tampão restante.

Para visualizar os fragmentos de DNA, remova o gel da bandeja de gel e exponha o gel à luz ultravioleta. Isso é mais comumente feito usando um sistema de documentação em gel. As bandas de DNA devem aparecer como bandas fluorescentes laranja.

Tire uma foto do gel no final do experimento, descarte adequadamente o gel e o buffer de corrida de acordo com os regulamentos da instituição. Esta figura representa um resultado típico após a eletroforese em gel aros de produtos de PCR. Após a separação, os fragmentos de DNA resultantes são como bandas claramente definidas.

O padrão ou escada de DNA deve ser separado em um grau que permita a determinação útil dos tamanhos das bandas de amostra. Neste exemplo, fragmentos de DNA de 765 pares de bases, 880 pares de bases e 1022 pares de bases são separados em um gel AROS de 1,5% com uma escada de DNA de dois logs. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de verificar novamente a colocação dos eletrodos antes de aplicar corrente.

Isso é para garantir que as moléculas de DNA viajem na direção certa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar uma célula agrícola, separar DNA, fragmentos de tamanhos de rolamentos e obter imagens representativas de seus resultados. Não se esqueça de que trabalhar com um brometo de três pode ser extremamente perigoso e precauções como usar luvas, óculos de proteção e jalecos devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.