Uso de Modelo Animal de Sepse para avaliar novas terapias à base de plantas

Sepse se refere a uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica resultante de uma infecção microbiana, e pode ser simulado por uma técnica cirúrgica chamada ligadura e perfuração cecal (CLP). Aqui nós descrevemos um método para usar CLP-induzida modelo animal para a tela ervas medicinais para agentes terapêuticos.

O objetivo geral deste procedimento é produzir um modelo de sepse em camundongos por um procedimento cirúrgico chamado Ligação e Punção SQL, ou CLP. Isso é feito primeiro fazendo uma incisão na linha média de 1,5 a dois centímetros no abdômen de um camundongo. Em seguida, o secum é exposto e ligado, então o sêum é perfurado para induzir a translocação bacteriana.

Finalmente, a incisão é fechada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram aumentos nos níveis de citocinas sistêmicas e peritoneais, bem como sintomas como letargia e letalidade. O que vou mostrar é produzir um modelo de sepse de camundongo denominado sação e punção, que é modificado a partir do modelo original desenvolvido pelo Dr. Chandry e seus colaboradores.

A principal vantagem média desse modelo é que ele é o modelo mais relevante de sepse. Além disso, é simples, bem caracterizado e economicamente viável, e por isso tem sido amplamente utilizado no campo da pesquisa de sepse e inflamação. Como exemplo, demonstraremos a utilização desse modelo para avaliar o potencial terapêutico do extrato fitoterápico na sepse.

Para preparar o extrato de ervas, mergulhe 10 gramas de ervas em 200 mililitros de água a 85 graus Celsius por uma a quatro horas para remover partículas insolúveis, centrifugue a fração de água a 3.300 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, filtre o sobrenadante através de um filtro de 0,2 mícron. Em seguida, concentrar o filtrado usando um filtro centrífugo com um corte de peso molecular de 10.000 quilodalton e girando a 5.000 G por 60 minutos a quatro graus Celsius.

O uso de culturas de macrófagos rastreou frações de baixo e alto peso molecular para inibir as atividades de mediadores pró-inflamatórios tardios, como o grupo de alta mobilidade box one ou HGB um. Para iniciar o isolamento dos macrófagos primeiro, o interperitoneal administrou dois mililitros de um caldo de glicol 4% TH em camundongos normais após três dias de colheita da cultura primária de macrófagos peritoneais, os macrófagos no DMEM suplementados com 10% FBS, dois milimolares de glutamina e 1% de penicilina. A estreptomicina lava suavemente os macrófagos aderentes com optimum e incuba-os no mesmo meio por duas horas.

Em seguida, estimule-os com a endotoxina bacteriana lipopolissacarídeo ou LPS 16 horas após a estimulação. Colete o meio condicionado por célula e use-o para realizar o western blotting. Para medir os níveis de HM GB um.

Quantifique a intensidade da banda usando uma curva padrão gerada com H mgb purificado para estabelecer sepse após anestesiar um camundongo com uma injeção intramuscular de 75 miligramas por quilograma de cetamina e 20 miligramas por quilograma de xilazina. E usando uma pinça no dedo do pé para verificar seu nível de sedação. Coloque o mouse em decúbito dorsal, limpe o abdômen e, em seguida, faça uma incisão na linha média de 15 milímetros para expor o ceco a aproximadamente cinco milímetros da ponta da sequência com uma sutura de seda de quatro oh.

Ligue o ceco e, em seguida, usando uma agulha de calibre 22, perfure o coto da sequela ligada uma vez para permitir a extrusão das fezes, retorne imediatamente o ceco à sua posição intra-abdominal normal e feche o abdômen. Depois que os animais recuperam a consciência e a mobilidade. Retorne a gaiola de volta para a sala dos animais em 24 horas.

Pós CLP intraperitoneal administrar 200 microlitros de extrato de ervas ou controle diariamente por três dias. Monitore a sobrevivência do animal pelo tempo necessário dentro de algumas horas após a ligadura e punção seqüilares, ou cirurgia CLP. Os animais apresentam sinais clínicos de sepse que incluem piloereção, letargia, amontoamento e diminuição da ingestão de alimentos e água.

Os animais que desenvolvem peritonite grave com infecção sistêmica consecutiva normalmente morrem dentro de 48 a 96 horas. No entanto, mesmo animais pareados por idade, sexo e origem genética podem responder à cirurgia de maneira distinguível no curso da sepse experimental, por exemplo, 48 horas após a CLP. Enquanto alguns animais podem ter se aproximado do estado de montículo conforme definido aqui, outros podem permanecer em um estado não moribundo.

Pesquisas abrangentes de citocinas circulantes revelaram diferenças dramáticas nos níveis de várias citocinas, incluindo IL seis, kc, MIP dois e ST nfr, um entre camundongos nos estados moribundo e não moribundo. Notavelmente, esses mediadores inflamatórios foram classificados como marcadores substitutos de sepse porque seus níveis circulantes são preditores confiáveis de desfecho letal na sepse experimental ou clínica. Além disso, a CLP induziu a liberação local de várias citocinas e quimiocinas pró e anti-inflamatórias, por exemplo, 48 horas após a CLP, quantidades significativas da citocina IL seis e das quimiocinas KC e MI P two ainda podem ser medidas não apenas sistemicamente no sangue, mas também localmente no fluido de lavagem peritoneal.

Aqui, as capacidades de vários extratos de ervas ou compostos de controle foram avaliadas quanto à sua capacidade de inibir a liberação de HGB induzida por endotoxina. Aqueles que tiveram a capacidade de inibir a liberação de HGB foram testados in vivo usando um modelo de sepse em camundongos. Devido à cinética tardia e prolongada do acúmulo de HGB um na sepse experimental, a primeira dose de inibidores do HGB um foi administrada 24 horas após o início da sepse, um ponto no tempo em que os camundongos desenvolveram sinais claros de sepse, incluindo letargia, diarréia e piloereção, como mostrado aqui, administração atrasada e repetida de um componente T verde principal epi Gallo, catequina três GALLATE ou EGCG começando 24 horas após o início da sepse, resgatou significativamente camundongos da sepse letal, mesmo quando administrado por via oral EGCG ainda resgatou camundongos da sepse letal, aumentando significativamente as taxas de sobrevivência dos animais de 16% para 44%Uma vez dominada esta ligadura e o modelo de punção pode ser concluído em menos de cinco minutos se for feito corretamente.