Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por In Utero Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Olá, meu nome é Federico K e sou líder de grupo no Centro de Terapias Regenerativas em Dresden, Alemanha. No filme a seguir, gostaríamos de mostrar algumas das técnicas que temos usado em nosso laboratório nos anos anteriores para controlar a mudança das células-tronco neurológicas de mamíferos da proliferação para a diferenciação e neurogênese. Em particular, descobrimos que quando superexpressamos a quinase dependente de ciclagem para o complexo D de ciclagem, podemos induzir a célula-tronco a encurtar a G e, durante esse tempo, as células sofrerão divisão proliferativa expandindo sua população em vez de neurogênese.

Curiosamente, quando essa manipulação é feita, transitoriamente e ciclando o CDK voltam ao nível fisiológico de expressão. Esse pool expandido de células-tronco pode mudar para neurogênese fisiológica. Como resultado de sua expansão, as células gerarão mais minerais e descobrimos que esse princípio se aplica tanto durante o desenvolvimento embrionário do córtex cerebral do camundongo quanto no hipocampo adulto.

Então, no próximo videoclipe, Christian Lange mostrará como essa manipulação pode ser realizada no desenvolvimento de embriões de camundongos, realizando eletroporação. Na segunda parte do nosso vídeo, Beja vai usar uma técnica conceptualmente semelhante, mas no cérebro adulto, especificamente no hipocampo, através da realização de injeção viral estereotáxica. Portanto, espero que essa técnica e esse tipo de manipulação possam ser úteis também para sua pesquisa em seus laboratórios e espero que você goste deste vídeo.

Olá, sou Christian Langer e hoje vou mostrar a vocês a expansão das células-tronco neurológicas no córtex de camundongos em desenvolvimento. Por exploração neutra de CDKs e ciclos. Uma barragem grávida é anodizada e colocada na mesa de operação aquecida.

Lá, como um fluxo de vapor é aplicado por meio de uma máscara de respiração que usamos como fluxo, porque sua administração constante permite um tempo preciso e flexível do ímã de operação. Para iniciar a operação, raspei cuidadosamente a barriga do mouse. A área raspada é desinfetada com solução de iodo pós-operatório e gia.

Eu injeto 100 microlitros da solução de tega por via subcutânea. Para injeção de DNA, usei o capilar de extração preenchido com DNA de plasma suplementado com D. Cortei a ponta fechada do capilar usando três s.

Todas as ferramentas foram esterilizadas por calor para abrir a barriga da mãe grávida. Eu realizo um corte longitudinal na linha média da pele abdominal usando uma tesoura. Todas as ferramentas cirúrgicas foram desinfetadas em um esterilizador de calor de batida de vidro.

Pela nossa experiência, é suficiente manter as ferramentas na plataforma de operação esterilizadas para evitar infecções bacterianas. O peritônio é cortado de forma análoga à pele abdominal sobrejacente, fazendo uma incisão longitudinal na linha média que abre a cavidade corporal. A cavidade é umedecida com a solução de eletroporação.

PBS suplementado com cinta de caneta para esta infecção e para facilitar a extração do útero. Depois de realizar a lipectomia, cobri o abdômen com campo cirúrgico estéril. Usando um afastador de tanque, abro a cavidade do corpo e agarro cuidadosamente o útero entre dois ces para puxar suavemente os dois chifres uterinos para fora da cavidade do corpo.

Para a operação, uso um camundongo grávida no Emry A 14. Nessa idade, os embriões são claramente visíveis no útero e a operação pode ser realizada Sem o uso de um microscópio. É muito importante para a sobrevivência dos embriões manter o útero coberto com a solução de eletroporação durante toda a operação.

Para a injeção do DNAI xadrez, pegue uma gema cuidadosamente com uma mão para manipular o embrião dentro. De tal forma que eu possa ver os hemisférios cefálicos, meus dedos seguram o saco para que o embrião dentro não possa se afastar da força da agulha e eu injeto através da parede uterina em um hemisfério até que o ventrículo seja delineado em azul pela solução de DNA colorida. Após a injeção, o útero é umedecido novamente com a solução de eletroporação E os eletrodos são colocados.

É essencial colocar o pólo pla do eletrodo no útero acima do hemisfério injetado e depois iniciamos as posturas elétricas usando o pedal. Os eletrodos são armazenados em PVS durante a operação para lavar os sais que se formam em contato. Durante a operação elétrica, o útero é umedecido novamente e eles continuam com o próximo embrião.

Quando todos os embriões são eletrooperados, eu novamente uso o afastador de tonelada para abrir o corte na cavidade do corpo para colocar os embriões com muito cuidado de volta para dentro, eu uso torneiras ou, se necessário, os dedos para colocar o útero dentro. Para fechar a ferida. Começo removendo o campo cirúrgico.

Eu uso suturas cirúrgicas para fechar o corte. No peritoneal, eu puxo a braça. Virei a ponta da agulha da braça duas vezes ao redor da pinça, agarrei a outra extremidade e puxei para realizar o nó cirúrgico.

É aconselhável dar o nó bem apertado e depois cortar as pontas com uma tesoura. Esta técnica é realizada a cada poucos milímetros até que o corte no peritônio esteja completamente fechado. O corte na pele abdominal é fechado.

Usando grampos cirúrgicos, uso uma pinça para criar um laço na pele, que é então preso. Usando este aplicador de grampo, a operação é concluída e o animal pode ser removido da máscara de luto para acordar e se recuperar. Dentro de cinco a 10 minutos, o animal acorda na plataforma de operação e pode ser transferido para sua gaiola de origem.

Um dia após a operação, a fêmea grávida é sacrificada e os embriões coletados com sucesso. Os eletroembriões são identificados em microscópio estereoscópico fluorescente. A expressão de repórteres fluorescentes em seu prosencéfalo mostrada aqui em um cérebro dissecado, uma seção transversal totalmente o córtex eletroporado, revisou as células radioggl inicialmente direcionadas na zona ventricular e sua progênie diferenciada, progenitores basais na zona subventricular e neurônios na zona intermediária e placa cortical.

Assim, a diferenciação das células elétricas pode ser determinada pela quantificação de células fluorescentes nessas diferentes zonas do córtex ou pela coloração com marcadores específicos para progenitores e neurônios de VA radioclaros. Ei, meu nome é Ani. Hoje vamos preparar alguns antivírus contra o HIV e depois mostrarei como injetá-los no cérebro de um rato barulhento.

Plaqueamos cinco para 10 a seis a nove três células T em cada prato de 10 centímetros com um total de 15 pratos usando demanda suplementada com 10% FCS e antibióticos. O segundo dia é a transmissão. Em primeiro lugar, vamos preparar a solução de DNA.

Temos três plasmídeos diferentes. Um é atual para a proteína DSPG, o segundo para as proteínas GPU e o último para nossos genes funcionais, então o segundo e o CDK quatro. Nesse caso, preparamos uma mistura maciça dos três plasmídeos para adicionar à mídia DN simples.

Feito isso, misturamos a solução de DNA. Em seguida, preparamos a solução PI. A solução PI é adicionada à solução DA.

É misturado e incubado por cerca de 1530 minutos em uma planta. Enquanto isso, substituímos a mídia de nossas placas por uma nova demanda contendo 15% FCS para ter uma concentração final de 10% FCS. Depois que a mistura de transformação é adicionada, adicionamos ao ML para o prato da mistura de transformação.

Nós o misturamos suavemente e depois levantamos as células em Cupra durante a noite. No terceiro dia, tratamos as células com butirato celular para reduzir a expressão do promotor CMD. Primeiro, adicionamos o butirato celular a todos os pratos.

Nós os incubamos por seis, oito horas a 37 graus, e então vamos mudar a mídia. O quarto dia é o último dia de nossa preparação. Coletamos a mídia de todos os pratos e, para nos livrarmos dos detritos celulares, filtramos.

Depois de coletar e filtrar o meio de todas as placas que transferimos no tubo, é importante equilibrar cuidadosamente os tubos da ultracentrífuga antes de prosseguir com a ultracentrifugação e, em seguida, obtemos as amostras no final da ultracentrifugação. Retiramos cuidadosamente nossas amostras e descartamos com muito cuidado, o palete é pouco visível e parece uma sombra no fundo do tubo. Lavamos o palete com PBS e depois incubamos o gelo por uma hora.

O há uma transferência suspensa do palato esses tubos menores e ultracentrífuga novamente, a paleta viral é resus suspensa em 50 mícrons de PBS e liquidada. A boca foi anestesiada como já descrito. Usando uma pinça, abrimos a boca e a fixamos na parte do palato da estrutura estereotáxica.

Em seguida, fixamos a cabeça com as barras aqui e Al é administrado. Como já mostrado. Aplicamos creme no gelo do mouse para evitar a cegueira.

Enchemos um capilar com óleo até a metade de seu comprimento, mais ou menos, e queremos o injetor de nanolitros que precisaremos para a injeção dos vírus. A pele da cabeça foi moldada e cuidadosamente desinfetada como já descrito. Para expor o crânio, posso a pele usando primeiro o bisturi e depois a tesoura.

Com o bastão de algodão, limpo suavemente a superfície do crânio. A ponta da tampa agora deve ser colocada em correspondência com o ponto prema. Para fazer isso o máximo de exercício possível, usamos a ajuda do microscópio ster.

Movemos o braço do quadro estereotáxico nos eixos Y e X até que a ponta da capacidade tenha sido colocada no bgma. Em seguida, definimos o valor que é mostrado no display digital. O quadro de sax do widget está conectado.

Em seguida, movemos o braço do quadro estereotáxico até não atingirmos as coordenadas desejadas mostradas no visor. Depois de colocarmos a ponta da capacidade nas coordenadas vermelhas, marcamos o ponto usando uma caneta marcadora com uma roda elétrica, eu abro um buraco neste ponto prestando atenção, não no cérebro danificado. A partir de agora começamos a trabalhar com vírus, por isso temos que tomar precauções especiais para evitar qualquer contaminação.

Os para são sempre mantidos em olhos secos com o keval e nós não o jogamos. Então eu pego cinco microlitros da suspensão do cano e eles deixam a gota em um pequeno pedaço de barbatana que eu coloquei anteriormente na barra de ar. Eu movo novamente a armação do braço até que a ponta do capilar esteja tocando a gotícula da suspensão do vírus.

O uso do controlador digital do pub de injeção de litro carregará a suspensão da bateria no capilar, sugando-a. Em seguida, movemos o capilar de volta para o lado das injeções. Uma vez que a ponta do capilar está tocando a superfície PL, eu reinicio o valor no eixo Z No display digital, a esquerda dos vírus é imediatamente descartada.

Lembre-se de que os vírus podem ser descontaminados com etanol, portanto, tudo o que poderia ser encontrado com a suspensão do vírus deve ser limpo com etanol. Agora é hora de injetar, então movemos a tampa no eixo Z, penetrando no tecido até chegarmos ao ponto de mordida e então iniciamos nossa injeção. É importante injetar os vírus a uma taxa de injeção muito baixa.

Neste caso, 1 55 nanolitros por minuto. Após o pla, esperamos dois minutos para evitar esse fluxo através do trajeto da agulha e, em seguida, retraímos o capilar no final. Fecha a pele como já foi mostrado.

O lixo está piscando um S dois recipientes e, em seguida, placa externa. Após a cirurgia, o camundongo pode ser perfundido com 4% Paraform dei. O cérebro pode ser dissecado e mais XI durante a noite em 4% do dia paraforme.

Eventualmente, o urânio empobrecido e/ou tamoxifeno ou outros componentes podem ser administrados antes do sacrifício de acordo com diferentes paradigmas para investigar a cinética do ciclo celular e interromper a expressão do transgene viral. Quando eles são flanqueados lateralmente, o cérebro pode ser processado para imunocoloração usando os marcadores ER para identificar caules e células progenitoras e neurônios como SOX, dois GFIP, nidificação T, dois Carin duplo ou outros. E isso pode ser usado para quantificar a proporção de diferentes populações de células.

Com isso, acho que você gosta de assistir a um vídeo e espero que isso possa ser útil para sua pesquisa.