Name: Determinação da acidez em fase gasosa de Oligopeptídeos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a determinar a acidez em fase gasosa de oligopeptídeos contendo cisteína usando o método cinético de Cook com espectrometria de massas. Esta técnica elimina efeitos de solvente para medidas precisas.

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<p class="jove_content"&gt; O trabalho foi financiado pela National Science Foundation (CHE-0749737). O uso do instrumento foi fornecido pelo Facility Mass Spectrometry da Universidade do Pacífico.</p

1. Preparação das Soluções Amostra <ol><li> Primeiro preparar as soluções de estoque de péptido e os seis ácidos de referência, utilizando um solvente misto de metanol e água numa proporção de 1:1 em volume. As soluções de reserva deve ter uma concentração de cerca de 10 -3 M. </li><li> Pesam-se 1 mg de péptido a amostra sólida, A 3 CH, num tubo Eppendorf de 1,5 mL e adicionar 1,0 ml de solvente misto de metanol e água, e misturar utilizando um vortex. </li><li> Pesam-se 1 mg de ácido difluoroacético (DFAH) e adicionar 1,0 ml da mistura de solventes de metanol e água, e misturar utilizando um vortex. </li><li> Use o mesmo procedimento para fazer as soluções estoque para os outros cinco referência ácidos ácido chloroacetic (MCAH), ácido bromoacético (MBAH), ácido dicloroacético (DCAH), ácido dibromoacetic (DBAH) e ácido trifluoroacético (TFAH). </li><li> Desenhar cerca de 50 ul da solução-mãe de péptido para um tubo Eppendorf de 1,5 ml, e extrair cerca de 50 ul da solução de estoque de DFAH na same tubo Eppendorf. Dilui-se a solução da mistura com 900 ul da mistura de solventes de metanol e água para se obter uma concentração final de cerca de 10 -4 M. Esta solução diluída será utilizada como a solução de amostra para as medições de espectrometria de massa. A proporção efectiva do péptido para o ácido de referência, bem como a concentração final da solução da amostra será ajustado com base nas abundâncias sinais observados iões no espectrómetro de massa. </li><li> Utilizar o mesmo procedimento para preparar as amostras de soluções do péptido com as outras cinco ácidos referência. </li></ol> 2. Espectrometria de Massa de medição 1: Proton-bound Cluster Formação Ion <ol><li> O primeiro passo na medição de espectrometria de massa é a de gerar iões de fragmentação de protões ligados estáveis ​​do péptido com um ácido de referência. </li><li> Definir o instrumento no modo de ião negativo MS, com a voltagem da agulha ESI -4,5 kV e a voltagem capilar de cerca de -35 V, e a temperatura do gás de secagemmantida a 150 ° C. Definir a largura do pico Q1 e Q3 a largura do pico, tanto com a escala calibrada (A largura do pico é um parâmetro de instrumento que pode ser utilizado para ajustar a resolução dos picos. A definição &quot;escala calibrada&quot; permite mostrar picos estreitos para uma melhor separação dos picos ). A voltagem capilar e a temperatura do gás de secagem pode ser ajustada para melhorar a abundância de iões observados. </li><li> Infundir cerca de 0,5 ml da solução de amostra de péptido-DFAH numa seringa Hamilton de 1 mL e ligar a seringa para a entrada da agulha ESI utilizando tubagem de PEEK. Em seguida, coloque a seringa na bomba de seringa. Ligar a bomba de seringa para infusão da solução de amostra para dentro da agulha ESI com a taxa de fluxo a 10 ml / min. </li><li> Ligue a tensão agulha ESI para ativar o processo ESI. Ligue o detector. Um espectro de massa de exibição deve ser observada no modo de perfil. Se a tela estiver em modo de baricentro, mude para o modo de perfil. Assista o cluster formação de iões de prótons ligados por monitoring do pico a m / z 428. A abundância do sinal do ião cluster pode ser ajustado por afinar o instrumento. Um parâmetro importante é a voltagem capilar. Pode-se alterar manualmente a voltagem capilar (tipicamente na gama de -20 a -50 V) para maximizar a abundância do pico a m / z 428. </li></ol> 3. Espectrometria de Massa de medição 2: As Experiências de Bracketing CID <ol><li> O próximo passo é realizar o experimento bracketing CID. </li><li> Uma vez que a abundância do íon conjunto atinge o valor desejado (cerca de 100 mV), desligue o aparelho para o modo MS / MS. Neste modo, as funções de Q1 como um filtro para isolar o ião de cluster, Q2 como funções da célula de colisão, e funções Q3 como o analisador de massa de massa. </li><li> Definir o gás de colisão (árgon, neste caso) pressão a 0,5 mTorr e a energia de colisão de 17 eV. Três picos devem ser observados na janela de exibição espectro de massa. O pico a m / z 428 corresponde ao ião de cluster, [DFA • H • A 3 CS] ¯. Os dois picos a m / z 332 e m / z 95 correspondem ao péptido desprotonada (A 3 CS ¯) e o ácido difluoroacético desprotonada (DFA ¯), respectivamente. O pico menor a m / z 298 é derivado de um fragmento do péptido desprotonada. Adquirir um espectro CID para 2 min, Figura 3a. </li><li> Realizar experiências semelhantes CID e adquirir um espectro CID para a solução da amostra do péptido com o ácido bromoacético (MBAH), Figura 3b. </li><li> Realizar experiências semelhantes CID e adquirir o espectro de CID para as soluções de amostra de péptido com todos os outros ácidos de referência. Os espectros de CID resultante será qualitativamente semelhantes às Figuras 3a e 3b, mas os valores m / z e as alturas relativas dos picos será diferente. </li></ol> 4. Mass Spectrometry Medição 3: O Método Kinetic <ol><li> O último passo é a aquisição de espectros SRM. </li><li> Ligue a tela do espectro de centróide e definir o instrumento para o modo de monitoramento de reação selecionada (SRM). Mantenha m / z 428 como o íon isolado pelo primeiro quadrupolo (Q1), e preencher quatro massas (relações massa-carga) a ser monitorados pelo terceiro quadrupolo (Q3). As quatro massas são m / z 428 (ião cluster), m / z 332 (ião péptido), m / z 298 (o fragmento do péptido de iões), e m / z 95 (a DFA ¯ iões). Mantenha a pressão do gás de colisão em 0,5 mTorr. </li><li> Defina a energia de colisão a 11,7 eV e adquirir os espectros de 5 min. </li><li> Alterar a energia de colisão de 17,6 eV e adquirir espectros durante 5 min. </li><li> Mude a energia de colisão de 23,4 eV e 29,3 eV, e adquirir o espectro em ambas as energias de colisão por 5 min. </li><li> Realizar medições similares para o péptido, com todos os outros ácidos de referência. </li></ol> 5. Análise de Dados <ol><li> Copiar os valores das intensidades de iões de all espectros SRM em uma planilha do Excel. </li><li> Calcule os produtos índices de ramificação íon CID, ln ([A ¯] / [A ¯ i]), medido para todos os seis grupos de prótons ligados em todas as quatro energias de colisão. Os valores de amostra são apresentadas na Tabela 1. </li><li> Plotar os valores de ln ([A ¯] / [A ¯ i]) contra os valores de Δ ácido H i - Δ ácido H média. Isto vai dar quatro parcelas correspondentes aos dados de quatro energias de colisão, a Figura 4a. </li><li> Extraia os valores das encostas e os intercepta por regressão linear das quatro parcelas. Neste caso, as pistas são valores positivos e as intercepções são valores negativos. Dê o símbolo &quot;X&quot; para as pistas eo símbolo &quot;Y&quot; para as interceptações. Os resultados são apresentados na Tabela 2. Multiplicar os valores de Y e por -1 usar o símbolo Y &#39;representar os valores positivos (isto permite que o eixo y disjogar valores positivos). Note-se, esta conversão é opcional, desde que os valores correspondentes são usados ​​para fazer o lote para a próxima etapa. </li><li> Plotar os valores de Y &#39;contra os valores de X, figura 4b. Regressão linear da trama dá uma inclinação de 1,706 e uma interceptação de -0,536. A inclinação corresponde ao Δ ácido H - Δ ácido H média. O valor médio Δ ácido H é conhecida por ser 330,5 kcal / mol, o que é determinado pelo conjunto de ácidos referência seleccionadas. O valor da acidez da fase gasosa do péptido é então obtido a partir do declive: Δ ácido H (A 3 CH) = 332,2 kcal / mol. </li></ol>

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Nada a divulgar.

A medição bem sucedida da acidez em fase gasosa de um péptido depende em grande medida a selecção de ácidos de referência adequados. Os ácidos de referência ideais são compostos orgânicos estruturalmente semelhantes com valores de acidez em fase gasosa bem estabelecidas. Os ácidos de referência deve ter estruturas semelhantes uns aos outros. Isto irá assegurar uma entropia de desprotonação semelhante para cada um dos ácidos de referência no conjunto. Os ácidos de referência deve ter valores de acidez próximas daquelas d...

A acidez de resíduos de aminoácidos estão entre as mais importantes propriedades termoquímicos que influenciam as estruturas, a reactividade, e os processos de dobragem de proteínas que se desdobram-9,19. Resíduos de aminoácidos individuais mostram muitas vezes diferentes acidez eficazes dependendo de suas localizações em proteínas. Em particular, os resíduos localizados nos locais activos exibem frequentemente perturbado significativamente a acidez. Um exemplo é o resíduo de cisteína residentes nos sítios ativos do thioredoxin super-família de enzimas 20,21. A cisteína sítio ativo é extraordinariamente ácidos em relação aos de proteínas desdobradas 3-5. Tem sido sugerido que a conformação helicoidal pode ter uma contribuição significativa para a acidez incomum. Existem amplos estudos experimentais sobre as propriedades do ácido-base de péptidos realizadas em soluções, especialmente em soluções aquosas 2,6-8. Os resultados foram muitas vezes complicada por efeitos do solvente7. Na verdade, a maioria dos sítios ativos das proteínas estão localizadas perto da região do interior, onde os efeitos de solventes são minimizados 9,10. A fim de compreender as propriedades dos péptidos e proteínas intrínsecas ácido-base, é importante para a realização dos estudos em um ambiente livre de solvente. Apresentamos aqui um método baseado em espectrometria de massa para a determinação da acidez em fase gasosa. A abordagem é referido como o método cinético prolongado cozinheiros. Este método tem sido aplicado com sucesso a uma grande gama de sistemas químicos para a determinação de diversas propriedades termodinâmicas, tais como a acidez da fase gasosa, a afinidade do protão, a afinidade de ião de metal, a afinidade de electrões, e a energia de ionização 11-15, 22-26. Aplicou-se este método para determinar a acidez em fase gasosa de uma série de oligossacáridos de cisteína-cisteína e polialanina poliglicina péptidos 17,18,27. Esses estudos mostram que a cisteína N-terminal peptídeoes são significativamente mais ácida do que os correspondentes de C-terminal. As altas acidez da primeira são provavelmente devido aos efeitos conformacionais helicoidais em que o anião tiolato é fortemente estabilizados pela interacção com a hélice a macro-dipolo. Devido à natureza não-voláteis e termicamente lábil de péptidos, o método de cinética é a abordagem mais prática actualmente disponíveis para produzir o ácido-base termoquímica quantidades razoavelmente precisos de péptidos 28. O esquema geral e a equação associado com o método cinético são mostrados na Figura 1. A determinação da acidez em fase gasosa de um péptido (AH) começa com a formação de uma série de aniões de fragmentação de protões ligados, [A • • H A i] ¯ (ou [A ¯ • • H + A i ¯] ¯), na região da fonte de iões do espectrómetro de massa, em que A e A ¯ i ¯ desprotonados são as formas do péptido eos ácidos de referência, respectivamente. Os ácidos orgânicos são os compostos de referência conhecidos, com a acidez da fase de gás. Os ácidos de referência deve ter estruturas semelhantes uns aos outros (mas não necessariamente idêntico ao do péptido). A semelhança de estruturas entre os ácidos de referência assegura a semelhança das entropias de desprotonação entre eles. O aglomerado próton-bound aniões são seleccionados de massa e collisionally activado e subsequentemente dissociado utilizando dissociação induzida por colisão (CID) experiências para produzir os correspondentes aniões monoméricos, A e A ¯ i ¯, com constantes de taxa de K e K i, respectivamente, mostrados na Figura 1A. Se fragmentações secundárias são negligenciáveis, a taxa de abundância dos iões de fragmentos CID, [A ¯] / [A i ¯], representa uma medida aproximada do rácio das constantes de velocidade, k / k i. Sob a hipótese de que não há activat reversabarreiras de iões para a dissociação de ambos os canais, o ião do produto de CID ramificação rácios, ln [A °] / [A i ¯], será linearmente correlacionada com a acidez da fase gasosa do péptido (Δ ácido H) e os dos ácidos de referência (Δ ácido i H), como mostrado na Figura 1b. Nesta equação, Δ ácido H médio é a acidez média de fase gasosa dos ácidos de referência, Δ (Δ S) é o termo de entropia (que pode ser assumida constante se os ácidos de referência são estruturalmente semelhantes uns aos outros), R é o constante universal dos gases e T é a temperatura ef eficaz do sistema. A temperatura efectiva é um parâmetro empírico que depende de diversas variáveis ​​experimentais, incluindo a energia de colisão. O valor da acidez da fase gasosa é determinado pela construção de dois conjuntos de gráficos de termo-cinéticos. O primeiro conjunto é obretidos pela traçando ln ([A ¯] / [A i ¯]) contra Δ ácido H i - Δ ácido H médio, como mostrado na Figura 4a. Regressão linear trará um conjunto de linhas retas com as encostas de X = 1 / RT FEP e interceptações de Y = - [Δ ácido H - Δ ácido H médio] / RT FEP - Δ (Δ S) / R. O segundo conjunto de parcelas é obtido através da representação gráfica dos intercepta resultantes (Y) a partir do primeiro conjunto de encontro às inclinações correspondentes (X), conforme mostrado na Figura 4b. A regressão linear produz uma nova linha com um declive de Δ ácido H - Δ ácido H médio e uma intercepção de Δ (Δ S) / R. O valor de ácido Δ H é então obtido a partir do declive e o termo entropia, Δ (Δ S) é obtido a partir dea interceptação. Os experimentos são realizados usando um espectrómetro de massa de triplo quadrupolo, interligados a uma ionização por electrospray (ESI), fonte de iões. Um diagrama esquemático do espectrómetro de massa é mostrado na Figura 2. As experiências são realizadas por CID massa escolhendo os aniões de fragmentação de protões ligados com a primeira unidade de quadrupolo e permitindo que eles sofrem colisões com átomos de árgon vazados para a câmara de colisão, que é realizada a uma pressão de cerca de 0,5 mTorr. Os iões dos produtos de dissociação são analisados ​​em massa com a terceira unidade de quadrupolo. Os espectros de CID são registrados em várias energias de colisão com a faixa de m / z grande o suficiente para cobrir todas as possíveis fragmentos secundários. As intensidades de iões produtos CID são medidos, definindo o instrumento no modo de monitorização de reacção seleccionada (SRM) no qual a verificação é focada em iões dos produtos seleccionados. Os experimentos são realizados CID em quatro diferentes energias de colisão, o que corresponde aenergias de centro de massa (E cm) de 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 eV, respectivamente. A energia de centro de massa é calculado utilizando a fórmula: E = E cm laboratório [M / (M + m)], onde E é a energia de laboratório colisão no quadro de laboratório, m é a massa de árgon, e M é a massa do ião de cluster protão ligado. Neste artigo, usamos o oligopéptido Ala 3 CysNH 2 (CH 3) como composto modelo. O C-terminal está amidado e o grupo tiol (SH), do resíduo de cisteína será o local ácido. A selecção dos ácidos de referência adequado é crucial para o sucesso da medida da acidez em fase gasosa. Os ácidos de referência ideais são estruturalmente semelhantes (entre si) compostos orgânicos com valores de acidez em fase gasosa bem estabelecidas. Os ácidos de referência deve ter valores de acidez mais próximos daquele dos péptidos. Para o péptido A 3 CH, seis halogenados carboxylic ácidos são escolhidos como os ácidos de referência. Os seis ácidos de referência são o ácido cloroacético (MCAH), ácido bromoacético (MBAH), ácido difluoroacético (DFAH), ácido dicloroacético (DCAH), ácido dibromoacetic (DBAH) e trifluoroacico (TFAH). Dois deles, DFAH e MBAH, irá ser usado para ilustrar o protocolo.

<table><tbody><tr><td>Espectrômetro de Massas</td><td>Varian</td><td>1200 L e 320 L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cloroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402923</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bromoacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B56307</td><td></td></tr><tr><td>Ácido difluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>142859</td><td></td></tr><tr><td>Ácido dicloroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D54702</td><td></td></tr><tr><td>Ácido dibromoacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242357</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da acidez em fase gasosa de oligopeptídeos

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Os resíduos de aminoácidos localizados em posições diferentes proteínas dobradas apresentam frequentemente diferentes graus de acidez. Por exemplo, um resíduo de cisteína localizado no ou perto do terminal N de uma hélice é muitas vezes mais ácido do que o que está em ou próximo do terminal C 1-6. Apesar de extensos estudos experimentais sobre as propriedades do ácido-base de péptidos foram efectuados na fase de condensado, em particular em soluções aquosas de 6-8, os resultados são muitas vezes complicada por efeitos do solvente 7. Na verdade, a maioria dos sítios ativos das proteínas estão localizadas perto da região do interior, onde os efeitos de solvente foram minimizados 9,10. A fim de compreender as propriedades dos péptidos e proteínas intrínsecas ácido-base, é importante para efectuar os estudos em um ambiente livre de solvente. Nós apresentamos um método para medir a acidez de oligopeptides na fase gasosa. Nós usamos uma cisteína contendo um oligopéptido, Ala 3 CysNH <sub&gt; 2 (CH 3), como composto modelo. As medições baseiam-se no método bem estabelecido cozinheiros cinético prolongado (Figura 1), 11-16. Os experimentos são realizados utilizando um espectrómetro de massa de triplo quadrupolo com uma interface de ionização por electropulverização (ESI), fonte de iões (Figura 2). Para cada amostra de péptido, vários ácidos de referência são seleccionados. Os ácidos orgânicos são os compostos de referência estruturalmente semelhantes conhecidos, com a acidez da fase de gás. Uma solução da mistura do péptido e de um ácido de referência é introduzida no espectrómetro de massa, e em fase gasosa de um protão ligado agrupamento aniónico do ácido péptido de referência é formado. O aglomerado próton-bound é massa isolada e posteriormente fragmentado via dissociação induzida por colisão (CID) experimentos. A abundância de iões dos fragmentos resultantes são analisados ​​usando uma relação entre as acidezes e cinéticas de dissociação do agrupamento de iões. A acidez da fase gasosa do péptido é então obtined por regressão linear das parcelas thermo-cinéticos 17,18. O método pode ser aplicado a uma variedade de sistemas moleculares, incluindo compostos orgânicos, aminoácidos e seus derivados, oligonucleótidos, e oligopéptidos. Ao comparar as acidezes de fase de gás medidos experimentalmente com os valores calculados para as diferentes conformações, os efeitos conformacionais nos acidez pode ser avaliada.

<ol><li> As experiências de escalonamento CID fornecer informação sobre as acidezes relativas do péptido em comparação com os ácidos de referência seleccionados. Dois espectros CID representante do peptídeo (CH 3) com dois ácidos de referência, e DFAH MBAH, são mostrados na Figura 3. Na Figura 3a a abundância de iões (altura do pico) do ião de péptido é mais fraca do que a de DFA ¯, e na Figura 3b, a abundância de iões dos iões péptido é mais forte do que a de MBA ¯. Os dois espectro...

A determinação da acidez em fase gasosa de oligopéptidos contendo cisteína é descrito. As experiências são realizadas utilizando um espectrômetro de massas triplo quadrupolo. Os acidezes relativas dos péptidos são medidos através de ensaios de dissociação induzida por colisão, e as acidezes quantitativos são determinados utilizando os Cook extensas método cinético.

Determinação da acidez em fase gasosa de Oligopeptídeos

Resíduos de aminoácidos localizados em diferentes posições em proteínas dobradas frequentemente exibem diferentes graus de acidez. Por exemplo, um resíduo de cisteína...

O objetivo geral deste procedimento é aplicar o método cinético de Cook para determinar a acidez em fase gasosa do peptídeo ine polialina. Isso é realizado primeiramente gerando íons em aglomerados ligados por prótons. O segundo passo consiste em realizar o experimento de dissociação induzida por colisão com técnica de delimitação.Em seguida, realiza-se o experimento de monitoramento da reação selecionada. O passo final é analisar os dados coletados dos experimentos de monitoramento da reação selecionada. Em última instância, o gráfico cinético é utilizado para gerar o valor da acidez em fase gasosa.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos convencionais, como experimentos de titulação realizados em solução, é que os efeitos do solvente podem ser eliminados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da química bioorgânica, como, por exemplo, quão ácido é um peptídeo em um ambiente livre de solvente. As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico das propriedades ácidas efetivas dos resíduos de aminoácidos localizados no interior das proteínas, uma vez que os efeitos do solvente são eliminados.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque as condições ideais de espectrometria de massas são difíceis de dominar sem uma demonstração visual. Esse método pode fornecer informações sobre as propriedades ácido-base intrínsecas de peptídeos. Pode ser muito bem aplicado a outros sistemas, como polímeros que imitam peptídeos e oligonucleotídeos.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando desejamos estudar os efeitos conformacionais nas propriedades ácido-base de peptídeos helicoidais. Inicie este protocolo com o preparo das soluções amostrais para o peptídeo polialina de cistina e seis ácidos carboxílicos halogenados conforme descrito no protocolo escrito que acompanha este vídeo. O primeiro passo da medição por espectrometria de massas é gerar íons estáveis de aglomerados ligados a prótons do peptídeo com um ácido de referência. Configure o instrumento no modo MS de íons negativos, com a tensão da agulha de ionização por eletrospray em menos 4,5 quilovolts, a tensão da capilaridade em cerca de menos 35 volts e a temperatura do gás de secagem mantida a 150 graus Celsius.Defina a largura do pico do primeiro e terceiro quadrupolo, ou Q1 e Q3, para a escala calibrada. A largura do pico é um parâmetro do instrumento que pode ser usado para ajustar a resolução dos picos. A configuração em escala calibrada permite a exibição de picos estreitos para uma melhor separação dos picos.A tensão capilar e a temperatura do gás de secagem podem ser ajustadas. Para aumentar as abundâncias iônicas observadas, infunda cerca de 0,5 mililitros da solução amostra do peptídeo de ácido difluoroacético em uma seringa Hamilton de um mililitro e conecte a seringa à entrada da agulha de ionização por eletrosspray ou ESI usando tubo peak. Em seguida, coloque a seringa na bomba de seringa.Ligue a bomba de seringa para infundir a solução da amostra na agulha ESI com uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto. Ligue a voltagem da agulha ESI para ativar o processo de ESI. Em seguida, ligue o detector.Deve-se observar a exibição do espectro de massas no modo perfil. Se a exibição estiver no modo OID, alterne para o modo perfil. Observe a formação do íon do agregado ligado ao próton monitorando o pico em MZ 4 28.Altere a largura do pico da escala calibrada para a escala 1,5. A abundância do sinal do íon em agregado pode ser ajustada com o ajuste fino do instrumento. Altere a tensão do capilar de menos 35 para menos 25 volts para maximizar a abundância do pico em MOZ 4 28.O próximo passo é realizar o experimento de dissociação induzida por colisão ou CID em modo de limitação. Quando a abundância do íon do agregado atingir o valor desejado em torno de 100 milivolts, mude o instrumento para o modo MSMS. Nesse modo, o Q1 atua como um filtro de massa para isolar o íon do agregado, o Q2 atua como célula de colisão e o Q3 funciona.Como o analisador de massa ajusta a pressão do gás de colisão em 0,5 militorr e a energia de colisão em 17 elétron-volts. Três picos devem ser observados na janela de exibição do espectro de massas. O pico em M sobre Z 4 28 corresponde ao íon do agregado.Os dois picos em M sobre Z 3 32 e M sobre Z 95 correspondem ao peptídeo desprotonado e ao ácido di-fluoroacético desprotonado, respectivamente. O pico menor em M sobre Z 2 98 é um fragmento secundário do peptídeo desprotonado. Adquira um espectro de CID por dois minutos, realize experimentos de CID semelhantes e adquira um espectro de CID para a solução da amostra do peptídeo com ácido promoacético.Em seguida, realize experimentos CID semelhantes e adquira os espectros CID para as soluções amostrais do peptídeo. Com todos os outros ácidos de referência, os espectros CID resultantes serão qualitativamente semelhantes, mas os valores de massa sobre carga e as alturas relativas dos picos serão diferentes. O último passo é adquirir os espectros de monitoramento da reação selecionada ou SRM.Altere a exibição do espectro para OID e configure o instrumento no modo SRM. Mantenha a pressão do gás de colisão em 0,5 militorr. Mantenha M sobre Z 4 28 como o íon isolado pelo primeiro quadrupolo e insira quatro valores de M sobre Z para serem monitorados pelo terceiro quadrupolo, preenchendo cada valor de M sobre Z quatro vezes. Os quatro valores de MZ são: 95 para o ácido difluoroacético desproteinizado, 2 98 para o fragmento do íon do peptídeo, 3 32 para o íon do peptídeo pep e 4 28 para o íon do agregado.Em seguida, altere a polaridade de positiva para negativa. Ajuste a energia de colisão para quatro valores diferentes de elétron-volts, incluindo 11,7, 17,6, 23,4 e 29,3. O conjunto de tensões é repetido quatro vezes para que os íons correspondentes sejam monitorados pelo terceiro quadrupolo.Adquira os espectros durante cinco minutos e realize medições semelhantes para o peptídeo com todos os outros ácidos de referência. Copie os valores das intensidades dos íons de todos os espectros SRM para uma planilha do Excel. Calcule as razões de ramificação dos íons produtos de CID medidos para todos os seis aglomerados protonados no total.Quatro energias de colisão. Represente graficamente os valores da razão de ramificação em função da diferença nos valores de acidez em fase gasosa. Isso fornecerá quatro gráficos correspondentes aos dados.Em quatro energias de colisão, extraia os valores das inclinações e dos interceptos por meio de regressão linear dos quatro gráficos. Neste caso, as inclinações são valores positivos e os interceptos são valores negativos. Atribua o símbolo X às inclinações e o símbolo Y aos interceptos.Multiplique os valores de Y por menos um e use o símbolo Y linha para representar valores positivos, a fim de permitir que o eixo Y exiba valores positivos. Essa conversão é opcional, desde que os valores correspondentes sejam utilizados para criar o gráfico na próxima etapa: plote os valores de Y linha contra os valores de x. A regressão linear do gráfico fornece uma inclinação de 1,706 e um intercepto de menos 0,536.A inclinação corresponde à diferença na acidez na fase gasosa. Sabe-se que o valor médio da acidez na fase gasosa é de 330,5 kcal por mol, o qual é determinado pelo conjunto dos ácidos de referência selecionados. O valor da acidez na fase gasosa do peptídeo é então obtido a partir da inclinação.Os experimentos de delimitação por CID fornecem informações sobre as acididades relativas do peptídeo em comparação com os ácidos de referência selecionados; dois espectros representativos de CID do peptídeo polialina de cisteína com dois ácidos de referência. Ácido acético diluído e ácido bromoacético são mostrados aqui neste espectro. A abundância iônica representada pela altura do pico do íon peptídico é mais fraca do que a do ácido difluoroacético desprotonado.Enquanto que no outro espectro, a abundância iônica do íon do peptídeo é maior do que a do ácido bromoacético desproteionado. Os dois espectros sugerem que a acidez em fase gasosa do peptídeo está na faixa entre esses dois ácidos de referência. O valor quantitativo da acidez em fase gasosa do peptídeo é determinado a partir de experimentos quantitativos de CID.Os gráficos termocinéticos para a dissociação dos agregados ligados por prótons do peptídeo com os seis ácidos de referência são mostrados aqui. A regressão linear dos gráficos de acordo com a relação termocinética entre a acidez gasosa VA e a razão de ramificação dos íons produtos de CID fornece o valor da acidez gasosa VA do peptídeo polialina de cisteína, que é 332,2 K cal por mol por método. Esta técnica pode ser realizada em cerca de cinco horas se for executada corretamente.Ao tentar este método, é importante lembrar-se de verificar primeiro o desempenho do espectrômetro de massas. Pode-se realizar uma calibração automática, se necessário, após este procedimento. Outros métodos, como modelagem molecular, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como as conformações mais prováveis do peptídeo após seu desenvolvimento.Essa técnica abre caminho para pesquisadores na área de espectrometria de massas explorarem uma variedade de sistemas moleculares em termos de propriedades termoquímicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o método de espectrometria de massas para medir acididades de gorduras gasosas. Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos é extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e óculos de segurança, devem ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

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Chemistry

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