Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

O objetivo geral deste procedimento é induzir danos precisamente controlados ao músculo esquelético de embriões de peixe-zebra, a fim de estudar os processos de regeneração muscular. Isso é realizado primeiramente rotulando geneticamente células musculares esqueléticas individuais de maneira mosaicada. Em seguida, embriões selecionados são embutidos em agarose contendo trica em uma lâmina.

Em seguida, os embriões são colocados sob o microscópio e células musculares específicas são lesionadas utilizando um laser de ponto microscópico. Por fim, os embriões são removidos dos agros e mantidos em recuperação por períodos definidos de tempo. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram alterações na organização dos miofibrilas mediante lesão a laser seguida de microscopia confocal.

O método que apresentamos hoje é relevante para o campo da regeneração muscular, mas também pode ser aplicado a outros paradigmas de regeneração, como a regeneração de nadadeiras e de peixe-zebra. Para rotular células, injete embriões de um estágio celular com um plasmídeo que codifique GFP ou qualquer proteína de fusão GFP sob o controle de um promotor ubíquo ou específico de tipos celulares. Durante o desenvolvimento, a GFP é então expressa de maneira mosaicada nos tecidos. Neste exemplo, o plasmídeo injetado faz com que células musculares individuais expressem alfa actina em GFP.

Sob o controle do promotor da beta actina, incubar os embriões até 28 horas pós-fertilização. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico equipado com uma lâmpada fluorescente para detectar actinina, usar pinças para revestir os embriões com clones GFP, preparando uma solução de agarose de ponto de fusão baixo a 1% e trica a 10% em meio E3, fervendo 100 miligramas de agarose em 10 mililitros de meio E3.

Deixe a solução esfriar até 39 graus Celsius e adicione trica para uma concentração final de 10%. Em seguida, prepare uma lâmina de microscópio com um anel de vaselina. Após adicionar a solução de agarose de ponto de fusão baixa ao anel de vaselina sob o microscópio, incorpore um único embrião na agarose de ponto de fusão baixa dentro do anel de vaselina. Com uma lamínula, cubra suavemente o embrião e alinhe paralelamente à lamínula para obter uma visão lateral perfeita.

Para preparar o laser de micro ponto, consulte o manual do laser de micro ponto para obter instruções detalhadas sobre como configurar e utilizar o laser. Em conjunto com o microscópio, selecione o corante laser CUMERIN quatro 40 para gerar um feixe de laser com comprimento de onda de 435 nanômetros. Utilizando o controle deslizante de atenuação, ajuste a potência do laser.

A potência do laser necessária para a ablação deve ser suficientemente forte para quebrar uma superfície de vidro com um único pulso. Consulte as instruções do fabricante para obter mais detalhes sobre o ajuste do laser usando o ponteiro vermelho instalado no ocular do microscópio. Foque na região ou célula de interesse.

Em seguida, prepare a luz necessária para visualizar a amostra. Então, aplique um ou vários pulsos de luz laser na região alvo, dependendo do grau de lesão desejado. Imediatamente após a lesão, use uma pipeta para remover suavemente o embrião do agros e coloque-o novamente na água de ovo para recuperação.

Após a recuperação pelo período desejado, fixe o embrião, realize imunohistoquímica e analise utilizando microscopia confocal. A lesão mediada por laser foi realizada em embriões imobilizados de um dia de idade. As colorações de Acton mostram que alguns pulsos a laser podem gerar uma pequena ferida, facilmente reconhecível pelos miófilamentos danificados que aparecem como espirais de actina. Um número maior de pulsos a laser resultará em somitos amplamente danificados, nos quais a maioria dos miófilamentos é destruída após cinco horas de recuperação.

A coloração da actina mostra que os miofibrilas dentro de pequenos locais de lesão se recuperaram e se estendem por toda a largura do somito. Descobrimos que a velocidade de recuperação depende do tamanho do tecido danificado, sendo que lesões menores cicatrizam mais rapidamente do que as maiores. Informações adicionais podem ser obtidas ao colorir o tecido lesionado com um anticorpo contra SERP um, que se localiza ao longo dos miofis em recuperação.

Dentro das células musculares lesionadas no local da lesão a laser indicado por um raio vermelho, a célula ablada apresenta fluorescência GFP reduzida. Esta figura demonstra que, após a fase de recuperação da lesão e coloração com anticorpos, a célula-alvo indicada pela seta branca é reconhecida com base no padrão de células rotuladas de forma mosaicada ao seu redor, conforme indicado pelas setas amarelas. A abordagem aqui apresentada permite acompanhar ao longo do tempo como a lesão mediada por laser afeta as células musculares semelhantes.

As células são registradas em tempo real para avaliar os efeitos imediatos nos primeiros minutos após a lesão a laser. Em seguida, podem ser realizados registros com intervalos de tempo para qualquer período desejado, a fim de acompanhar de perto como as células se reorganizam ao redor dos ferimentos. Neste exemplo de imagem em tempo real, a seta preta indica onde o laser lesa o músculo semítico aos 30 HPF.

As extremidades de uma célula muscular danificada estão lentamente se retraindo em direção aos limites do mioto, à esquerda e à direita da seta preta. Este método pode ser usado em conjunto com outras técnicas, como Q-R-T-P-C-R ou Western Blot, para determinar alterações na expressão gênica ou na expressão proteica. Além disso, análises com imagens de longa duração podem ser realizadas para investigar, por exemplo, a resposta imune após lesão orgânica.

Portanto, este método tem realmente muitas aplicações possíveis.