Dissecção, Cultura, Análise e de

O objetivo geral deste procedimento é preparar um cultivo celular primário de células retinianas de Xenopus. Isso é realizado primeiramente removendo os tecidos circundantes para expor a retina. O segundo passo é ressecar o tecido retiniano.

Em seguida, o tecido retiniano é dissociado em células isoladas. O passo final consiste em semear as células da retina em uma placa não clonada e adicionar fluo-4 AM para imageamento de cálcio. Por fim, utiliza-se microscopia confocal para detectar a atividade de cálcio em cultura de células retinianas.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia do desenvolvimento, neurobiologia e biologia celular, como o papel do cálcio e da atividade elétrica no desenvolvimento da retina, bem como a expressão gênica em nível de célula única. Em geral, indivíduos novos neste procedimento enfrentarão dificuldades, pois movimentos finos de motricidade são necessários para dissecações rápidas e precisas. A demonstração visual deste método é essencial, já que as etapas da dissecação são difíceis, exigindo movimentos complexos de coordenação motora e visual.

Para iniciar este procedimento dentro da câmara de fluxo laminar, prepare e rotule o seguinte: uma placa de Petri plástica de 60 milímetros contendo 10 mililitros de meio de cultura celular, a ser utilizada como placa de dissecação. Opcionalmente, pode-se adicionar 10 miligramas de colagenase B à placa de dissecação, obtendo-se uma concentração final de 1,0 miligrama por mililitro, para auxiliar na separação das camadas teciduais durante a dissecação de embriões na fase 25 ou mais jovens.

Além disso, prepare um prato de superfície de 35 milímetros contendo dois mililitros. Meio de cultura celular a ser usado como placa de cultura, um tubo microcentrífugo vazio de 1,5 mililitro a ser usado como tubo de dissociação de explante e um tubo cônico tipo Falcon de 15 mililitros contendo 15 mililitros.

Meio de cultura celular. Em seguida, prepare dois pratos de Petri plásticos de 35 milímetros contendo dois mililitros, CMF para dissecção, sendo um destinado a ser usado como placa de dissociação de explante, e o outro como placa de lavagem de explante fora da cabine de segurança. Prepare dois pratos de Petri plásticos de 60 milímetros contendo 10 mililitros.

0,1 XMMR, um para ser usado como placa de retenção, o outro como placa irmã, e mais um terceiro prato de Petri plástico de 60 milímetros contendo 10 mililitros de 0,1 XMMR mais 0,5 miligramas por mililitro de MS 2 22. Após isso, adicione 40 microlitros de tripsina a 5% em CMF à placa de dissociação de explantes.

Agite para misturar e, em seguida, reserve. Em seguida, prossiga com a dissecação usando um microscópio estereoscópico e dois pares de pinças finas. Faça um corte sagital mediano na face ventral do embrião, começando pela extremidade posterior e continuando através da glândula de cimento na porção anterior do embrião.

Abra cuidadosamente o embrião separando ambos os lados do corte. Isso faz com que o lado dorsal do embrião fique voltado para a placa de dissecação. Em seguida, abra o ectoderma ventral para revelar o endoderma e o mesoderma.

Em seguida, remova o endoderma e o mesoderma, a primeira e maior camada desse tecido. O endoderma apresenta-se muito frouxo, com células grandes e pouca organização evidente. Após a remoção dessa camada, os somitos e o Noor ficarão visíveis.

Para melhor contraste, transfira o embrião para uma placa de Petri plástica separada de 60 milímetros contendo 10 mililitros de meio de cultura celular e 100 microlitros de solução a 1% de sulfato de azul de Nile e incube por dois a três minutos. Em seguida, transfira-o de volta para a placa de dissecação. Isso corará o ectoderma, os somitos e o Noor, facilitando a identificação e a orientação.

Focalizando na porção anterior do embrião, remova cuidadosamente o Noor e qualquer mesoderma remanescente para expor o cérebro e as vesículas ópticas. Uma vez que o cérebro e as vesículas ópticas estejam completamente expostos, use a pinça para seccionar o tubo neural e o ectoderma subjacente logo posterior ao cérebro. Vire esta porção de modo que o ectoderma fique voltado para cima.

Use cuidado para evitar danificar as vesículas ópticas subjacentes e remova cuidadosamente o ectoderma. Por fim, separe as vesículas ópticas do cérebro com a pinça para dissecar um embrião com idade superior à fase 25. Primeiro, remova a porção ventral do embrião com a pinça na placa de anestesia.

Para melhor contraste, transfira o embrião para uma placa de Petri plástica de 60 milímetros contendo 10 mililitros de MMR 0,1 X e 100 microlitros de sulfato de azul de Nilo a 1% por dois a três minutos para corar o ectoderma. Em seguida, transfira-o para a placa de dissecação. Então, mantendo o embrião no lugar, remova cuidadosamente a retina ou vesícula óptica que está diretamente abaixo do ectoderma sobrejacente.

Uma vez que a vesícula óptica ou a retina tenha sido dissecada, transfira-a cuidadosamente para a placa de lavagem X explan com uma micropipeta P100 utilizando uma ponteira resistente a aerossóis. Tenha cuidado para não permitir que entre em contato com quaisquer fronteiras ar-líquido. Em seguida, deixe o explan repousar por 30 segundos.

Em seguida, transfira 80 microlitros de tripsina a 0,1% em CMF da placa de dissociação do explante para o tubo de dissociação do explante. Depois disso, transfira a retina ou vesícula óptica da placa de lavagem do explante para o tubo de dissociação do explante. Evite transferir a solução de lavagem do explante.

Em seguida, deixe o tecido dissociar-se no tubo de dissociação explantar por uma hora à temperatura ambiente. Se forem necessárias múltiplas imagens das células ao longo do experimento, fixe uma grade na parte inferior da placa de cultura com pequenas gotas de cola supercola. Isso permitirá capturar imagens das mesmas células em orientações idênticas em diferentes momentos do procedimento para semear as células.

Primeiro, remova lentamente 40 microlitros da solução do tubo de dissociação do explante e descarte. Em seguida, utilize a pipeta P 100 com uma ponta resistente a aerossóis para transferir lentamente as células para a placa de cultura. Ao aspirar as células para a placa, pipete lentamente e mantenha as células em uma pequena área no centro da placa.

Esta figura mostra um exemplo da atividade de cálcio de uma única célula durante uma hora de aquisição de imagens. Essas figuras fornecem resultados representativos de experimentos de imagem de cálcio em células retinianas embrionárias analisadas em diferentes estágios de desenvolvimento. Resumidamente, os resultados mostram que o cálcio é regulado durante o desenvolvimento, com picos de atividade no estágio 35 em termos de correlação da atividade de cálcio com células positivas para uma sonda específica.

Em experimentos com peixes, embora não tenham sido observadas diferenças estatisticamente significativas, houve uma tendência de que células positivas para um marcador GABAérgico apresentassem níveis mais elevados de atividade de pico de cálcio em comparação com células positivas para um marcador glutamatérgico ou para a expressão do gene PT F1 A.A, que codifica um fator de transcrição associado à promoção do fenótipo GABAérgico. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de três horas e trinta minutos para uma placa, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como cultivo celular, hibridização C dois ou gravações eletrofisiológicas, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como quais células expressam marcadores fenotípicos específicos ou para analisar gravações eletrofisiológicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar tecido retiniano, dissociar tecido retiniano e semear células retinianas.