Dissecção, Cultura, Análise e de Xenopus laevis Tecido embrionário da retina

Xenopus laevis proporciona um sistema de modelo ideal para o estudo da especificação célula destino e função fisiológica de células individuais da retina em cultura celular primária. Aqui apresenta-se uma técnica para dissecar os tecidos da retina e geração de culturas de células primárias que têm imagem para a actividade de cálcio e analisados ​​por hibridação in situ.

O objetivo geral deste procedimento é preparar a cultura de células primárias de células retinianas de xenopus. Isso é feito removendo primeiro os tecidos circundantes para expor a retina. O segundo passo é extirpar o tecido da retina.

Em seguida, o tecido da retina é dissociado em células únicas. A etapa final é colocar as células da retina em um prato não clonado e adicionar gripe oh 4:00 AM para imagens de cálcio. Em última análise, a microscopia confocal é usada para detectar a atividade do cálcio na cultura de células da retina.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia do desenvolvimento, neurobiologia e biologia celular, como o papel do cálcio e da atividade elétrica no desenvolvimento da retina, bem como a expressão gênica em um único nível celular. Geralmente, os indivíduos novos neste procedimento terão dificuldades porque os movimentos motores finos são necessários para dissecções oportunas e precisas. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de dissecção são difíceis porque os intrincados movimentos olho-mão são essenciais.

Para iniciar este procedimento dentro do exaustor, prepare e rotule o seguinte, um Placa de Petri de plástico de 60 milímetros contendo 10 mililitros. Meio de cultura celular a ser utilizado como placa de dissecação. Opcionalmente, 10 miligramas de colagenase B podem ser adicionados à placa de dissecação para uma concentração final de 1,0 miligramas por mililitro para auxiliar na separação da camada de tecido para dissecação de embriões no estágio 25 ou menos.

Além disso, prepare 1 prato de superfície de 35 milímetros contendo dois mililitros. Meio de cultura celular a ser utilizado como placa de cultura. Um tubo de microcentrífuga vazio de 1,5 mililitro para ser usado como tubo de dissociação de explicação e um tubo de falcão cônico de 15 mililitros contendo 15 mililitros.

Meio de cultura celular. Em seguida, prepare 2 placas de Petri de plástico de 35 milímetros contendo dois mililitros, CMF para dissecação, uma para ser usada como placa de dissociação de explicação, a outra como uma placa de enxágue de explicação X fora do exaustor. Prepare duas placas de Petri de plástico de 60 milímetros contendo 10 mililitros.

0,1 XMMR, um para ser usado como placa de retenção, o outro como placa irmã e mais uma placa de Petri de plástico de 60 milímetros contendo 10 mililitros, 0,1 XMMR mais 0,5 miligramas por mililitro. MS 2 22. Depois disso, adicione 40 microlitros, 5% de tripsina em CMF à placa de dissociação explicativa.

Agite para misturar e reserve. Em seguida, prossiga com a dissecção usando um escopo de dissecação, usando dois pares de pinças finas. Faça um corte sagital médio no lado ventral do embrião, começando na extremidade posterior e continuando pela glândula de cimento na porção anterior do embrião.

Abra cuidadosamente o embrião, espalhando os dois lados do corte. Isso resulta no lado dorsal do embrião voltado para a placa de dissecção. Em seguida, abra o ectoderma ventral para revelar o endoderma e o mesoderma.

Em seguida, remova o endoderma e o mesoderma, a primeira e maior camada desse tecido. O endoderma é muito fofo na aparência, com células grandes e pouca organização óbvia. Depois de remover esta camada, os somitos e Noor se tornarão visíveis.

Para melhor contraste, transfira o embrião para uma placa de Petri de plástico separada de 60 milímetros contendo 10 mililitros, meio de cultura de células e 100 microlitros de solução a 1% de sulfato de azul do Nilo e incube por dois a três minutos. Depois, transfira-o de volta para a placa de dissecação. Isso manchará o ectoderma, os somitos e Noor para facilitar a identificação e orientação.

Concentrando-se na porção anterior do embrião, remova cuidadosamente o Noor e qualquer mesoderma restante para expor o cérebro e as vesículas ópticas. Uma vez que o cérebro e as vesículas ópticas estejam completamente expostos, use a pinça para cortar o tubo neural e o ectoderma subjacente logo posterior ao cérebro. Vire esta porção para que o ectoderma fique por cima.

Tenha cuidado para evitar danificar as vesículas ópticas subjacentes e remova cuidadosamente o ectoderma. Finalmente, separe as vesículas ópticas do cérebro com a pinça para dissecar um embrião com mais de 25 anos. Primeiro, remova a porção ventral do embrião com uma pinça na placa de anestesia.

Para melhor contraste, transfira o embrião para uma placa de Petri de plástico de 60 milímetros contendo 10 mililitros, 0,1 XMMR e 100 microlitros de sulfato de azul do Nilo a 1% por dois a três minutos para corar o ectoderma. Em seguida, transfira-o para a placa de dissecação. Em seguida, segurando o embrião no lugar, remova cuidadosamente a retina ou vesícula óptica que fica diretamente abaixo do ectoderma sobreposto.

Uma vez dissecada a vesícula óptica ou retina, transfira-a cuidadosamente para a placa de enxágue X explan com uma micropipeta P 100 usando uma ponta resistente a aerossóis. Tenha cuidado para não permitir que ele toque em nenhum limite de ar líquido. Em seguida, deixe o explan descansar por 30 segundos.

Em seguida, transfira 80 microlitros de 0,1% de tripsina em CMF da placa de dissociação explan para o tubo de dissociação explan. Depois disso, transfira a retina ou vesícula óptica da placa de enxágue explane para o tubo de dissociação explan. Evitando a transferência da solução de enxágue explan.

Em seguida, deixe o tecido dissociar no tubo de dissociação por uma hora em temperatura ambiente. Se várias imagens das células forem tiradas durante o experimento, prenda uma grade na parte inferior da placa de cultura com pequenas gotas de super cola. Isso permitirá que imagens de células idênticas em orientações idênticas sejam tiradas em diferentes pontos do procedimento para colocar as células.

Primeiro, remova lentamente 40 microlitros da solução do tubo de dissociação explanável e descarte. Em seguida, use o P 100 com uma ponta resistente a aerossóis para transferir lentamente as células para a placa de cultura. Ao aspirar as células para a placa, pipete lentamente e mantenha as células em uma pequena área no centro da placa.

Esta figura mostra um exemplo da atividade do cálcio de uma única célula ao longo de uma hora de imagem. Esses números fornecem os resultados representativos de experimentos de imagem de cálcio em células embrionárias da retina, conforme analisados em diferentes estágios de desenvolvimento. Resumidamente, os resultados mostram que o cálcio é regulado pelo desenvolvimento com picos no estágio 35 em termos de correlação da atividade do cálcio com células positivas para uma sonda específica.

Em experimentos com peixes, embora não tenha havido diferenças estatisticamente significativas, houve uma tendência de células positivas para um marcador GABAérgico exibirem níveis mais altos de atividade de pico de cálcio do que células positivas para um marcador glutamatérgico ou para a codificação do gene PT F1 AA, um fator de transcrição correlacionado com a promoção do fenótipo GABAérgico Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de três horas e 30 minutos para uma placa, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como cultura de células e hibridização C dois ou registros eletrofisiológicos, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como quais células expressam marcadores fenotípicos específicos ou para analisar registros eletrofisiológicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar o tecido da retina, dissociar o tecido da retina e as células da retina em placas.