Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

O objetivo geral deste procedimento é integrar imagens ao vivo de marcadores fluorescentes com culturas embrionárias de camundongos e fatias de neuroepitélio. Isso é feito cruzando primeiro a linha de camundongos Cree induzível com a linha repórter Cree para rotular geneticamente as células visivelmente em divisão. Em seguida, os embriões inteiros de camundongos são dissecados e cultivados in vitro na presença de lentivírus.

Em seguida, o embrião é fatiado e a seção do tubo neural é preparada para imagens ao vivo. Finalmente, a fatia do tubo neural é visualizada com microscopia confocal de lapso de tempo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a observação direta de divisões celulares únicas dentro do neuroepitélio em desenvolvimento em tempo real por meio de imagens ao vivo ex vivo.

Portanto, a força deste protocolo é que podemos monitorar células individuais in vivo e isso nos permite fazer perguntas sobre os eventos de sinalização de cada célula, bem como o comportamento de cada célula. Para começar, cruze a linha de camundongos Cree induzíveis por tamoxifeno, CAGG CRE ER, com a linha de repórter DS Red Cree. Para monitorar o tempo relativo da resposta do ouriço sônico nas células-filhas, cruze a linha vermelha do CAGG CRE ER ds com OG dois EEG.

Camundongos transgênicos FP de volta dissolveram tamoxifeno em 100% de etanol e injetaram intraperitoneal em fêmeas grávidas a E 6,5 para induzir a expressão de CRE e a marcação de vermelho DS em um pequeno subconjunto de células embrionárias. 48 horas depois, após dissecar os embriões, use um microscópio fluorescente para identificar embriões vermelhos positivos para DS. Transfira-os para uma placa de cultura e observe as divisões celulares únicas durante a imagem ex vivo.

Dissecar os embriões E 8,5 em meio de lavagem pré-quente contendo uma solução um-para-um de D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% de soro de bezerro recém-nascido e 1% de estreptomicina de penicilina. Usando um microscópio fluorescente com um estágio aquecido a 37 graus Celsius, ou trabalhando próximo a uma placa quente de 37 graus, identifique imediatamente os embriões como GFP e/ou DS RED positivo. Transfira até dois embriões para uma gota de 500 microlitros de cultura pré-equilibrada. Média.

Aplique uma fina camada de óleo mineral leve equilibrado sobre o meio para evitar a evaporação e incube a placa de cultura contendo os embriões a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para rotular os cílios no neuroepitélio, adicione cinco a 10 microlitros de S sst, lentivírus R 3G FP, aproximadamente 2 milhões de variantes a uma gota equilibrada de 500 microlitros de meio de cultura contendo um embrião. Após a cultura por 18 horas, transfira o embrião infectado para várias gotas de meio de lavagem para lavar o vírus e prepare fatias de tubo neural.

Transfira um embrião para um prato revestido de ágar 1% e use uma microfaca de 0,025 milímetro para dissecar o tubo neural. Coloque uma gota de 150 microlitros de meio de cultura equilibrado sem vermelho de fenol em um prato de fundo de vidro revestido de poliol lisina de 35 milímetros e coloque o lado ventral do tubo neural isolado. Na gota do meio, coloque pequenas quantidades de uma mistura um-para-um de vaselina e cera de vela derretida ao redor do tubo neural montado e pressione suavemente uma lamínula de vidro na geléia para imobilizar a amostra.

Cubra o prato com uma fina camada de óleo mineral leve equilibrado para obter a imagem. Use um microscópio confocal invertido equipado com uma câmara ambiental ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Use uma objetiva de imersão em óleo de 60 x para obter imagens de células vermelhas positivas CLIA e DS marcadas com GFP e uma objetiva de imersão em óleo de 40 x.

Para monitorar LIC duas células vermelhas positivas GFP e DS, abra o software de elementos NIS para configurar condições de imagem de lapso de tempo. A cada 10 minutos, adquira Zacks de até 25 mícrons de espessura com espaçamento de 1,5 mícrons. Ao usar uma objetiva de 40 x e empilhar até oito mícrons com um espaçamento de 0,4 mícron para uma objetiva de 60 x, consulte o protocolo de texto para obter mais instruções.

Após a fixação e incorporação do tecido na OCT, use um criostato para preparar cortes e realizar imunofluorescência de acordo com o protocolo de texto. Aqui, realizamos imagens ao vivo ex vivo de divisões celulares únicas dentro do neuro epitélio de camundongo E 8.5 para rotular células individuais. Induzimos a CRE recombinase em um subconjunto de células contendo uma linha repórter Cree que expressava vermelho DS após a recombinação, como visto aqui, 48 horas depois, divisões celulares únicas foram observadas por meio de imagens exvivo, incluindo um repórter transcricional sonic hedgehog, modificado de volta transgênico oli duas linhas EGFP.

Fomos capazes de monitorar quando as células se tornaram responsivas ao ouriço sônico para observar a formação de CLIA, os lentivírus SST R 3G FP foram gerados e usados para infectar embriões em cultura, os resultados da imagem confocal de lapso de tempo dos embriões repórter DS Red Cree expressando EG dois EGFP ou infectados com lentivírus SSTR 3G FP durante a cultura in vitro são mostrados aqui. Um dos poderes dessa abordagem é que podemos incorporar alelos genéticos mutantes em segundo plano, o que nos permite perguntar o que genes específicos fazem com o comportamento celular individual e os eventos de sinalização.