Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133 + Células-tronco de câncer putativos Melanoma

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer culturas de células derivadas de pacientes de melanomas malignos e isolar células-tronco cancerígenas putativas CD 1 33 positivas. Isso é feito preparando primeiro células únicas de melanoma primário de um tecido tumoral após o esgotamento dos eritrócitos do pellet celular. Se necessário, caracterize a cultura de células primárias e deplete os fibroblastos.

A etapa final é realizar a classificação magnética das células de melanoma CD 1 33 positivas e CD 1 33 negativas. Em última análise, este procedimento máximo otimizado é um excelente método para obter populações altamente enriquecidas e viáveis de células CD 1 33 positivas e CD 1 33 negativas. Primeiro usamos a técnica para validar dados insco em medicina personalizada, onde tentamos prever a resposta a medicamentos de pacientes com câncer e para isso nenhuma linhagem celular disponível comercialmente pode ser usada.

A principal vantagem da técnica é que temos acesso rápido às células positivas CD 1 33, que são células-tronco cancerígenas putativas no melanoma maligno. A técnica será apresentada por Catherine Davis, técnica de laboratório do meu laboratório. Transfira o tecido tumoral recém-isolado da cirurgia para o laboratório de cultura de tecidos em PBS estéril contendo 1% de estreptomicina de penicilina.

Transfira o tecido tumoral para uma placa de Petri estéril, aspire o excesso de solução. Em seguida, adicione 500 microlitros de mistura de dissociação e pique o tumor em pequenos pedaços de dois a quatro milímetros usando bisturis estéreis frescos. Agora transfira dois a quatro gramas de tecido tumoral picado para um tubo C máximo suave contendo cinco mililitros de mistura de dissociação.

Enxágue a placa de Petri com uma mistura de dissociação adicional de 4.5 mililitros e adicione os fragmentos de tecido restantes ao tubo C máximo suave. Feche o tubo, prenda-o de cabeça para baixo na manga da dissociação e execute o programa H tumor zero um. Em seguida, incube a amostra por 30 minutos a 37 graus Celsius sob rotação contínua na velocidade de execução mais alta.

Agora prenda o tubo de cabeça para baixo na manga da dissociação e execute o programa H tumor zero dois. Em seguida, incubar a amostra por 30 minutos a 37 graus Celsius sob rotação contínua a 12 RPM. Em seguida, execute o programa Max suave H tumor zero três.

Ressuspenda a amostra e passe a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons para um tubo de 50 mililitros. Se necessário, agite a suspensão celular com uma ponta de filtro estéril até que a suspensão completa passe. Enxágue o filtro de células com cinco mililitros quantum 2 6 3 medium pellet a suspensão celular por cinco minutos a 300 G e descarte o sobrenadante.

Se o palato celular parecer lido devido a uma grande quantidade de tiques e mentiras, os glóbulos vermelhos conforme detalhado no protocolo de texto complementar. Gire novamente as células tumorais em quantum 2 6 3 e semeie uma cultura rotineiramente de células de passagem quando atingirem 80% de confluência. Analise a cultura de células primárias fenotipicamente usando um microscópio.

Em seguida, colha uma pequena quantidade da cultura de células primárias para extração de RNA após a síntese de CD NA e realize R-T-P-C-R com primers para melanoma neoplásico, células-tronco e genes marcadores de células do estroma. Os genes mais importantes a serem analisados são o marcador de fibroblastos CD 90, o marcador de melanoma e melanócitos rasgar o marcador de células-tronco cancerígenas CD 1 33, o marcador para células dendríticas maduras, CD 83 e um gene de manutenção como HPRT ou GAAP dh. Se a análise microscópica combinada e R-T-P-C-R revelou uma alta contaminação por fibroblastos da cultura primária de melanoma, prossiga para esgotar os fibroblastos usando as colunas anti-fibroblastos, microesferas e LD.

Lave 80% das células de confluência com PBS pré-quente, adicione a quantidade adequada de Accutane e incube até que as células se desprendam da superfície da cultura. Colha as células em meio quântico 2 6 3 e transfira para um tubo de 50 mililitros. Enumere as células e centrifugue o número necessário de células por cinco minutos a 300 G e quatro a oito graus Celsius.

Aspirar completamente o sobrenadante e resus. Suspenda até uma vez 10 até as oitavas células em 350 microlitros de tampão máximo adicione 100 microlitros de reagente bloqueador de FCR e 50 microlitros de CD 1 33. Uma biotina.

Misture bem e incube a quatro graus Celsius por 10 minutos. Lave as células com tampão máximo de 10 mililitros, seguido de centrifugação por cinco minutos a 300 G e quatro a oito graus Celsius. Aspirar completamente o sobrenadante após uma segunda lavagem.

Ressuspenda o pellet celular em 400 microlitros de tampão máximo. Adicione 100 microlitros de microesferas anti-biotina e misture bem, incube a quatro a oito graus Celsius por 15 minutos. Enquanto isso, para preparar o separador máximo para a separação magnética, conecte o quadro max ao suporte multis do separador máximo.

Insira o número necessário de colunas LS com as asas da coluna para a frente no campo magnético do quadro max. Coloque um filtro de pré-separação em cada coluna LS e um tubo de coleta apropriado. Sob cada coluna, enxágue o filtro e a coluna com um tampão máximo de três mililitros e descarte o fluxo.

Depois de lavar as células no tampão máximo conforme descrito anteriormente, ressuspenda as células no tampão máximo de 500 microlitros e aplique a suspensão da célula na coluna LS preparada. Lave três vezes com um buffer máximo de três mililitros por coluna. Colete o afluente total da fração de células negativas cd 1 33 não marcada.

Em seguida, descarte o filtro de pré-separação. Retirar a coluna do separador e colocá-la sobre um tubo de recolha adequado. Aplique no máximo cinco mililitros de tampão.

Lave imediatamente as células positivas CD 1 33 marcadas empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna para aumentar a pureza da fração negativa. Aplicar a suspensão de células numa nova coluna LS equilibrada e recolher a fracção negativa CD 1 33 do efluente. Esta metástase linfonodal ressecada foi obtida de um paciente com melanoma em estágio avançado.

Após a dissociação mecânica e enzimática do tecido, o pellet de células filtradas continha uma alta contaminação com eritrócitos. Posteriormente, a depleção dos glóbulos vermelhos resultou em um pellet celular de cor marrom claro. Essas células foram cultivadas em meio quântico 2 6 3 aqui, um R-T-P-C-R de melanócitos e melanoma, fibroblastos, dendríticos e marcadores de células-tronco.

Genes é usado para verificar se as células se originaram do tumor e não do estroma circundante. Os melanócitos adultos serviram como células de controle normais para a lágrima e a linha celular de carcinoma embrionário NCCIT como controle positivo para o marcador de células-tronco CD 1 33. Esses dados revelam que algumas células primárias são de fato positivas para lágrimas e, portanto, de origem melanocítica.

A cultura também é negativa para CD 83, o marcador de células dendríticas maduras. Curiosamente, esta linha celular de melanoma expressa CD 1 33, um gene crucial para a divisão celular assimétrica e um conhecido marcador de células-tronco cancerígenas. Aqui é mostrada uma micrografia de campo claro de uma cultura de células primárias altamente contaminada com fibroblastos após o tratamento para depleção de fibroblastos, as culturas representam células primárias de melanoma.

As células primárias do melanoma foram classificadas em células CD 1 33 positivas e CD 1 33 negativas. Esses dados de imunofluorescência, coloração e análise de western blot indicam alta eficácia e pureza de triagem. A abordagem tem grandes implicações para a medicina personalizada porque agora podemos usar tecidos e células derivados de pacientes para prever melhor a resposta medicamentosa de cada paciente individualmente.

Este método nos ajudará a responder a perguntas-chave como: de onde o tumor deriva? Como os pacientes podem ser tratados? E ajudará a redefinir melhor as abordagens da biologia de sistemas, validando seus experimentos.