Em organoide Cultura in vitro de primário do mouse tumores do cólon

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer organoides de tumor de cólon de neurônio primário. Isso é feito coletando primeiro tecido tumoral de cólon de camundongo. O segundo passo é dissociar o epitélio normal do cólon adjacente.

Em seguida, as células tumorais do cólon são digeridas em células únicas. A etapa final é incorporar células tumorais de cólon em matrigel e cultivá-las seletivamente com condições limitadas de nutrientes. Em última análise, a microscopia de luz é usada para mostrar o curso do tempo de formação de um organoide de tumor de cólon.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como linhagens de células de câncer de cólon transformadas, é que as culturas organoides imitam de perto o estado in vivo e geram dados fisiologicamente mais relevantes. Depois de sacrificar o camundongo com dióxido de carbono e coletar o cólon, lave o cólon com PBS. Use uma tesoura para abrir o cólon longitudinalmente, coloque-o sob um microscópio estéreo e use uma tesoura para remover regiões que contenham tumores.

Colete e lave o tecido tumoral com PBS. Após a lavagem, transfira os fragmentos intestinais para a quelação de EDTA, tampone e incube no gelo por 60 minutos após a quelação, a maioria das células epiteliais intestinais normais será destacada enquanto as células tumorais permanecerão presas ao mechy. Aspire o tampão quelante contendo células epiteliais normais e lave os fragmentos tumorais restantes.

Mais uma vez. Com cinco mililitros de tampão de quelação a frio. Após aspirar o tampão quelante, lave os fragmentos tumorais com cinco mililitros de um XPBS frio.

Depois de aspirar um XPBS, adicione tampão de digestão aos fragmentos de tecido e incube por duas horas. A 37 graus Celsius, deixe os fragmentos tumorais assentarem sob gravidade normal por um minuto e, em seguida, colete o sobrenadante S em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Pulverizar a suspensão de tumor de célula única supinada centrifugando a 200 vezes G durante três minutos.

Em seguida, lave uma vez com cinco mililitros de PBS e centrifugue. Novamente, ganhe ressuspender o pellet tumoral com 500 microlitros de PBS. Em seguida, conte as células tumorais isoladas usando um hemocitômetro.

Em seguida, enrole as células tumorais centrifugando a 200 vezes G por três minutos e reenvie cinco miligramas por mililitro de matrigel no gelo. Em seguida, coloque 15.000 células em um volume de 50 microlitros de matrigel por poço em uma placa de 24 poços. Depois de permitir que a mistura de células matrigel polimerize por 15 minutos a 37 graus Celsius, adicione 500 microlitros de meio de cultura basal contendo 50 nanogramas por mililitro de urina EGF a cada poço, troque o meio de cultura basal contendo EGF a cada dois dias e massageie os organoides de um a cinco uma vez por semana para massagear.

Depois de substituir o meio de cultura por meio basal fresco, use uma pipeta P 1000 com uma ponta de pipeta cortada para romper mecanicamente os organoides e o matrigel. Transfira a suspensão organoide para um tubo de falcão de 15 mililitros. Use uma pipeta de macarrão polido a fogo para interromper ainda mais os organoides.

Lavar os organoides dissociados com cinco mililitros de cultura basal, meio e centrifugar 200 vezes G durante dois minutos. Em seguida, descarte o supinato, ressuspenda o pellet com matri gel e placa conforme descrito anteriormente para congelar organoides, dissociar, lavar e centrifugar. Como antes, descarte o supinado e resus.

Suspenda o pellet em DMEM contendo 20% de soro bovino fetal e 10% de óxido de dimetilsulfo. Em seguida, transfira a suspensão celular para tubos criogênicos de 1,5 mililitro. Transfira os tubos para um recipiente de congelamento Nalgene Mr.Frosty e armazene em um freezer de 80 graus Celsius negativos para atingir uma taxa de resfriamento de menos um grau Celsius por minuto.

Após a incubação durante a noite, transfira as células para nitrogênio líquido. As células podem ser armazenadas dessa maneira por mais de dois anos. Para extração de RNA, as células são coletadas.

Quanto à passagem, o RNA é isolado usando o kit de isolamento de RNA pico puro. De acordo com as instruções do fabricante para extração de proteínas, o pellet celular é coletado da maneira usual e, em seguida, fica em 100 microlitros de tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio para imuno-histoquímica. Depois de aspirar o meio de cultura de células, use uma pipeta P 1000 cortada para transferir organoides tumorais para um molde criogênico.

Coloque o molde em gelo seco e adicione meio de congelamento de tecido ao molde corte de seções congeladas em sete mícrons e manche De acordo com protocolos publicados anteriormente, esta imagem mostra uma formação organoide representativa derivada de um tumor de cólon retirado de um camundongo PC min de três meses, pouco tempo após o revestimento. Esta imagem mostra o mesmo organoide um dia após o revestimento. Aqui, o organoide está em cultura há três dias.

Enquanto esta imagem mostra o organoide seis dias após o revestimento. Aqui são mostrados dois organoides que estão em cultura há 14 dias. Observe que, neste estágio, cada organoide consiste em um aglomerado de células.

Este histograma mostra a taxa bem-sucedida de formação de organoides sob duas condições diferentes de digestão da colagenase. Essas imagens mostram organoides derivados de um tumor de cólon retirado de um camundongo PC min de três meses de idade com coloração imunofluorescente para beta-catenina. O IPS foi usado para corar os núcleos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer o tumor primário do cólon na urina OID por digestão enzimática.