Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected
May 30th, 2013
As células T reguladoras CD4+ são potentes imunomoduladores e desempenham funções importantes na homeostase imunológica. A escassez dessas células no sangue periférico torna os estudos funcionais desafiadores, especificamente no contexto da infecção pelo HIV-1. Descrevemos aqui um método para isolar e expandir Tregs CD4+ funcionais do sangue periférico de indivíduos infectados pelo HIV-1.
O objetivo geral deste procedimento é avaliar o fenótipo e a função supressora de células T reguladoras positivas de quatro DC naturais expandidas do sangue periférico de indivíduos HIV V positivos. Isso é feito isolando primeiro as células T reguladoras por densidade, gradiente e classificação celular baseada em fluxo. Na segunda etapa, as células T reguladoras são expandidas em cultura.
Em seguida, o fenótipo das células expandidas é caracterizado por citometria de fluxo na etapa final, a função da população TRE expandida é avaliada por um ensaio de supressão de células T. A investigação do TRE natural quatro positivo para DC em indivíduos infectados pelo HIV tem sido tradicionalmente desafiadora e, em grande parte, devido à escassez da população. A vantagem de nossa técnica é que ela permite a geração exvivo de um grande número dessas células muito raras.
O método demonstrado aqui pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunopatogênese do HIV, facilitando a caracterização da função e especificidade das células T reguladoras na progressão da doença pelo HIV. Embora esse método possa fornecer informações sobre as células T reguladoras do sangue periférico, ele também pode ser aplicado a outros compartimentos do corpo, como a expansão de células T reguladoras do tecido linfóide associado ao intestino. Um importante local de replicação do HIV Comece transferindo cuidadosamente o sangue dos tubos de coleta de CD A para tubos cônicos de 50 mililitros para um volume final de 15 mililitros de sangue por tubo.
Em seguida, adicione 25 microlitros de roseta ep, CD humano quatro coquetel de enriquecimento de células T positivas por mililitro de sangue. Misture cuidadosamente e incube as suspensões celulares por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, misture cuidadosamente 15 mililitros de PBS suplementado com 2% de FBS com o sangue.
Em seguida, coloque a amostra de sangue diluída em cima de 15 mililitros de histo em um tubo cônico de 15 mililitros. Gire o sangue por 20 minutos a 1200 Gs e temperatura ambiente com um início lento e sem interrupções e, em seguida, transfira a camada de PBMC enriquecida com células T positivas para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Lave as células em PBS suplementado com FBS.
Conte as células e, após outra lavagem, ressuspenda o pellet em cerca de 20 vezes 10 elevado a seis células por 200 microlitros. Adicione os seguintes anticorpos nas concentrações indicadas e, em seguida, incube as células por 30 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Depois de lavar o anticorpo não ligado, suspendemos as células em 20 vezes 10 elevado a seis células por mililitro em PBS adicional mais FBS e filtramos a suspensão celular através de uma malha de náilon de 35 micrômetros.
Agora, usando um classificador de células equipado para o manuseio de material de risco biológico, classifique o CD três CD positivo quatro CD positivo 25 CD positivo 1 27 baixo treg em meio ex vivo 15. Usando essa estratégia de gating, as células T convencionais CD três CD positivo quatro CD positivo 25 CD negativo 1 27 podem ser isoladas e expandidas como controles negativos. Após a classificação, lave as células do T-Rex com meio ex vivo 15 e ressuspenda o pellet a 250 vezes 10 elevado a três células por mililitro.
In vivo 15 meios suplementados com penicilina sérica humana e estreptomicina. Em seguida, depois de lavar o ativador T humano CD três, CD 28 contas, de acordo com as instruções do fabricante, adicione as contas às células isoladas do T-Rex na proporção de uma para uma conta por célula. Então, após dois dias de cultura, dobre o volume do meio e adicione IL dois às células.
Agora cultive, as células T-Rex por duas semanas, mudando a mídia nos dias 5, 7, 9 e 12. No nono dia, adicione contas à cultura na proporção de um para um no final da expansão da cultura. Lave as células T convencionais e reguladoras colhidas em PBS.
Em seguida, use o kit de coloração de células mortas violetas fixáveis de mortos vivos. De acordo com o protocolo do fabricante para corar as células mortas, lave o excesso de mancha em PBS e FBS. Em seguida, adicione os seguintes anticorpos nas concentrações indicadas e incube as células em 30 minutos no escuro a quatro graus Celsius.
Após outra lavagem, core as células com um tampão de coloração Fox P de três fatores de transcrição de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione os seguintes anticorpos nas concentrações indicadas e adquira os dados num citómetro de fluxo. Também no final da cultura de expansão descongelar criopreservado autólogo, ex vivo pbmc.
Descanse as células por cerca de três horas em uma incubadora de 37 graus Celsius em meio completo. Depois de corar as células mortas como acabamos de demonstrar, lave as células em PBS com FBS e, em seguida, incube as células com anti CD três, PE tamanho sete por 30 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Depois de lavar as células.
Novamente, suspenda novamente o pellet em PBS e FBS e filtre a suspensão celular através de malha de náilon de 35 micrômetros e, em seguida, use um classificador de células equipado para manusear material de risco biológico para classificar as células T positivas CD três viáveis em meio R 10. Após a classificação, as células marcadas com CFSE, de acordo com as instruções do fabricante, ressuspendam as células em meio r mais suplementado com soro humano em uma vez 10 das seis células por mililitro. Agora colha as células T-Rex expandidas e Resus, suspenda-as em 0,5 vezes 10 elevado a seis células por mililitro em meio R 10 humano.
Em seguida, divida a cultura de células em 0,2, cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro e 0,125 vezes 10 elevado a seis células por mililitro de diluição. Próximo Resus suspender anti CD dois, anti CD três, anti CD 28 microesferas preparadas de acordo com as instruções do fabricante a 0,75 vezes 10 das seis contas por mililitro em meio humano R 10. Em seguida, dilua ainda mais os grânulos com mais meio R 10 para três concentrações finais diferentes de 0,6, 2, 5, 0,562 e 0,5 vezes 10 dos seis grânulos por mililitro, respectivamente.
Cultura, as suspensões de células diluídas e grânulos em uma placa inferior redonda de 96 poços de acordo com este protocolo. Após quatro dias de cultura, lave as células e incube-as por 30 minutos a quatro graus Celsius com esses anticorpos. Por fim, adquira os dados em um citômetro de fluxo.
Esta primeira figura representa a estratégia de gating usada para fluir classificar CD único três positivo, CD quatro positivo, CD 25 positivo CD 1 27, TREGS baixo de PBMC, isolado de um HIV V um indivíduo positivo, os clones de anticorpos anti CD 25 e anti CD 1 27 e seus conjugados são cruciais para uma boa separação da população de treg. Neste exemplo representativo, a expansão do treg atingiu uma mudança de 765 vezes após 14 dias de cultivo. A mudança na dobra de expansão pode variar de um indivíduo para outro e pode variar de 100 vezes a 2.500 vezes acima da população inicial.
Nesta figura, os histogramas cinzas representam a coloração para marcadores treg selecionados. Por exemplo, CTLA quatro, Fox, P três e Helios. Uma característica fundamental das células T reguladoras é sua capacidade de suprimir a função efetora das células T usando um ensaio padronizado de proliferação de células T baseado em fluxo.
Esta figura mostra como as células TT reguladoras podem suprimir a proliferação de células T ativadas em diferentes proporções de células T para Treg. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e expandir tregs funcionais de indivíduos HIV positivos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de aplicar critérios rigorosos de gating para a classificação do T-Rex, pois as células T convencionais também serão expandidas e podem contaminar e crescer demais a cultura de células após este procedimento.
Outros estudos, como comparar a função ou expressão gênica do HIV fluorescente in vitro infectado versus tregs não infectados, podem ser realizados. Não se esqueça de que trabalhar com amostras HIV positivas pode ser perigoso, pois precauções como seguir procedimentos operacionais rígidos de patógenos transmitidos pelo sangue e trabalhar com um pedido de venda equipado para lidar com material de risco biológico devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visão geral
Este artigo apresenta um método para isolar e expandir células T reguladoras CD4+ (Tregs) do sangue periférico de indivíduos infectados pelo HIV-1. A técnica aborda os desafios impostos pela escassez dessas células, permitindo estudos funcionais no contexto da infecção por HIV-1.
Principais componentes do estudo
Área da ciência
- Imunologia
- Pesquisa sobre HIV
- Biologia celular
Fundo
- CD4+ Tregs desempenham um papel crucial na regulação imunológica.
- Sua baixa abundância no sangue periférico complica a pesquisa.
- Entender os Tregs na infecção por HIV-1 é vital para estratégias terapêuticas.
- Os métodos atuais para estudar essas células são limitados.
Propósito do estudo
- Desenvolver um método confiável para isolar CD4+ Tregs de indivíduos infectados pelo HIV-1.
- Expandir essas células para análise funcional.
- Avaliar seu fenótipo e funções supressivas.
Métodos utilizados
- Isolamento de CD4+ Tregs usando gradiente de densidade e citometria de fluxo.
- Expansão de Tregs isolados em cultura.
- Caracterização do fenótipo celular via citometria de fluxo.
- Avaliação da função Treg usando um ensaio de supressão de células T.
Principais resultados
- Isolamento e expansão bem-sucedidos de CD4+ Tregs do sangue periférico.
- Caracterização dos Tregs expandidos demonstrou marcadores fenotípicos esperados.
- Tregs expandidos exibiram funções supressivas significativas em ensaios.
- O método permite a geração de grandes números de Tregs para estudo.
Conclusões
- O método desenvolvido fornece uma ferramenta valiosa para estudar CD4+ Tregs na infecção por HIV-1.
- Ele supera limitações anteriores relacionadas à escassez de células.
- Os resultados podem informar futuras abordagens terapêuticas visando Tregs no HIV.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Expanding regulatory T cells from HIV-1-infected individuals addresses a critical bottleneck in immunology research, enabling functional studies of a rare but therapeutically relevant cell population. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in HIV vaccine and immunotherapy development by providing sufficient material for phenotypic and functional characterization. Overcoming cell scarcity improves predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Treg-mediated immune modulation in HIV-1 pathogenesis to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Provides expanded Tregs for functional assays that validate target engagement and mechanism of action.
- Scientific Value: Supports phenotypic confirmation of FOXP3, CTLA4, and HELIOS expression to de-risk target specificity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates large numbers of Tregs for standardized suppression assays to evaluate immunomodulatory compounds.
- Operational Value: Establishes reproducible expansion protocols that ensure assay readiness and scalability across screening campaigns.
- Scientific Value: Enables quantitative readouts of Treg suppressive function at defined effector-to-Treg ratios for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by expanding Tregs from HIV-1-infected donors to study immune homeostasis in pathogenic context.
- Operational Value: Supports longitudinal functional testing to assess Treg stability and suppressive capacity over extended culture periods.
- Scientific Value: Connects peripheral blood Treg expansion to tissue-derived compartments like gut-associated lymphoid tissue for broader translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by enabling isolation and expansion of Tregs for downstream phenotypic screening and functional validation, supporting lead identification through mechanistic de-risking of immunomodulatory targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Treg role in HIV-1 immune activation versus suppression by providing expandable primary cells.
- Screening: Delivers standardized Treg preparations for suppression assays that yield quantitative, reproducible outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables flow cytometry-based phenotyping and suppression assay readouts that inform comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical validation by allowing Treg expansion from autologous sources for disease-relevant functional testing.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for Treg expansion applicable to multiple HIV-1 cohorts and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling functional assessment of Tregs in HIV-1 context.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible expansion of rare Tregs to reduce variability in functional assays.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale studies from limited donor samples, reducing need for repeated primary isolations.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying immunomodulatory mechanisms early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry sorting and sterile cell culture handling for biohazardous HIV-1 samples.
- Depends on access to cell sorters equipped for biosafety level 2 conditions and anti-CD3/CD28 beads for Treg expansion.
- Necessitates standardization of gating strategies (CD3+CD4+CD25+CD127low) across operators to ensure Treg purity.
- Involves adaptation considerations for applying the method to tissue-derived lymphocytes such as gut-associated lymphoid tissue.
- Limited by donor variability in Treg expansion fold change, which ranges from 100- to 2,500-fold and requires pilot testing for each sample.
