Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

O objetivo geral deste procedimento é induzir um grau de isquemia consistente e funcionalmente mensurável. A reperfusão induziu lesão renal aguda em camundongos por meio de pinçamento pedicular renal unilateral, seguido de isquemia de nefrectomia contralateral. A lesão de reperfusão é obtida fazendo uma incisão dorsal e expondo o pedículo renal esquerdo e direito.

Isso inclui a artéria e a veia renais. Em seguida, uma nefrectomia contralateral é realizada após a liberação do rim do tecido circundante. Em seguida, o pedículo renal esquerdo é pinçado usando uma pinça vascular e o rim é coberto com a pele.

Finalmente, após um tempo predeterminado, a pinça é liberada, o rim pode se reperfundir e o rim é empurrado de volta para o espaço retroperitoneal. Em última análise, a análise funcional da lesão renal pode ser realizada por meio da análise dos níveis séricos de creatinina usando um ensaio em cascata enzimática 24 horas após a remoção da isquemia renal contralateral. A lesão de reperfusão é um modelo amplamente utilizado para estudar os mecanismos e o tratamento da lesão renal aguda.

A técnica em si é relativamente simples, mas há uma série de variáveis que resultaram em muitos laboratórios, achando a técnica difícil de reproduzir com alta mortalidade e também rendimento relativamente baixo, com indivíduos capazes de realizar apenas cinco a 10 cirurgias por dia. O Dr. Skrinick, que apresentará a técnica a você mais tarde, passou vários anos desenvolvendo a técnica em nosso laboratório e desenvolveu um protocolo que descobrimos ser muito mais reprodutível com baixa mortalidade e rendimento relativamente alto. Em um dia bom, NA é capaz de formar de 40 a 50 cirurgias por dia para se preparar para a cirurgia.

Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos se eles forem usados para vários camundongos, trate-os usando um esterilizador de esferas quentes entre os procedimentos. Se estiver usando um sistema de banho-maria, ajuste o calor em 38 graus Celsius uma hora antes da cirurgia, pese o camundongo e, em seguida, administre uma injeção subcutânea de 0,5 mililitros de solução salina normal estéril. Depois de anestesiar um camundongo usando uma injeção intraperitoneal de alaína, mistura de cetamina, raspe a área cirúrgica e aplique pomada oftálmica para proteger as córneas do camundongo.

Transfira o mouse em decúbito ventral para uma superfície aquecida forrada com uma almofada de bancada absorvente e prenda as pernas na superfície cirúrgica usando a solução de Betadine. Esfregue do centro do local em direção à periferia, seguido por novacan um total de três vezes. Cubra o campo cirúrgico com o campo cirúrgico estéril.

Em seguida, palpe a localização do rim através da pele. Em seguida, corte a pele dorsal ao longo da linha média do camundongo com uma tesoura e uma pinça. Separe a pele e as camadas subcutâneas sobre os lados dorsais esquerdo e direito através da incisão.

Faça uma pequena incisão no músculo do flanco direito e na fáscia acima do rim direito e exteriorize-a com cuidado, disseque os pólos superior e inferior do rim livres do tecido circundante. A glândula adrenal também é removida suavemente do pólo superior do rim direito, juntamente com seu suprimento sanguíneo, separando suavemente o tecido com uma pinça romba usando um movimento de varredura de medial para lateral. Isso é um pouco difícil de demonstrar por vídeo, mas pode ser entendido.

Olhando para a anatomia da glândula adrenal com seu suprimento sanguíneo ilustrado na figura um, em seguida, usando uma sutura de seda de quatro oh, dê um nó cirúrgico duplo ao redor do hilo. Deixe uma extremidade da sutura com cerca de cinco centímetros de comprimento e use-a para segurar o rim para visualizar o local do corte enquanto corta distal ao nó. Use solução salina estéril para irrigar o toco.

Em seguida, com sutura absorvível, feche a camada muscular movendo-se para o lado esquerdo. Faça uma pequena incisão no músculo do flanco esquerdo e na fáscia acima do rim esquerdo e exteriorize-a com uma pinça romba. Segure cuidadosamente o rim enquanto libera o pedículo renal do tecido adiposo circundante com um segundo conjunto de pinças.

Tomando cuidado para não exercer muita pressão sobre o rim, o que pode causar lesão renal. Se você estiver incluindo controles operados por simulação em seus experimentos, os camundongos operados por simulação devem passar exatamente pelos mesmos procedimentos que os camundongos feridos, incluindo a liberação do pedículo renal da gordura circundante, mas o grampo vascular não é colocado no pedículo renal. Em seguida, ao estabilizar a pinça de retenção renal, use uma pinça vascular não traumática para pinçar o pedículo renal esquerdo, os tempos de pinçamento variam dependendo da tensão do camundongo e da gravidade da lesão necessária com a pinça ainda no lugar.

Cubra o rim esquerdo com a pele e, em seguida, use gaze estéril embebida em solução salina para cobrir a incisão na pele. Em seguida, cubra o mouse com uma cortina estéril para proteger o campo cirúrgico após o período de tempo desejado, exponha o rim. Verifique se ele tem uma aparência escura uniforme e, em seguida, solte o clamp.

O rim deve assumir rápida e uniformemente uma aparência rosada após a reperfusão. Empurre suavemente o rim de volta para o espaço retroperitoneal. Em seguida, feche a camada muscular com sutura absorvível e feche a pele com clipes, administre 0,05 microgramas por grama de analgesia com buprenorfina e 0,5 mililitros de solução salina normal estéril por via subcutânea.

Em seguida, transfira o mouse para uma almofada de aquecimento e deixe-o acordar antes de transferi-lo para a sala de animais até cinco. Os camundongos podem ser colocados em cada gaiola após a cirurgia, monitorar de perto o camundongo e administrar analgesia adicional conforme necessário a cada oito a 12 horas para dor ou desconforto em nossa mão. A lesão unilateral de IR com nefrectomia contralateral simultânea reduz substancialmente a variabilidade dos resultados quando comparada com a lesão bilateral de IR.

Com este procedimento, 50 a 60% dos camundongos desenvolvem a insuficiência renal esperada dentro de 24 horas após a lesão. Em termos práticos, isso significa que ainda há uma variabilidade significativa usando este modelo, uma vez que os camundongos restantes desenvolvem muito pouca lesão ou têm lesões muito mais graves. Para nossos propósitos, somos capazes de minimizar esse problema.

Uma vez que os grupos de tratamento que usamos geralmente são iniciados 24 horas ou mais após a lesão inicial. Desta forma, os camundongos podem ser randomizados para diferentes membros de tratamento após a obtenção da creatinina de 24 horas. Camundongos com valores de creatinina fora de uma faixa predeterminada são excluídos de estudos adicionais neste momento.

Para lesões moderadas, geralmente excluímos camundongos com valores de creatinina sérica fora de uma faixa de 0,8 a 1,2 miligramas por decilitro. Além de realizar RI unilateral com nefrectomia contralateral simultânea, realizamos RI unilateral isoladamente. Os camundongos podem sobreviver a períodos muito mais longos de isquemia e tendem a desenvolver fibrose pós-lesão mais grave.

No entanto, como é difícil avaliar a recuperação funcional com lesão unilateral de RI neste modelo, não há como avaliar a gravidade da lesão sem a coleta de tecidos renais e isso pode não ser possível para estudos de longo prazo. Por esse motivo, desenvolvemos um protocolo para induzir lesão unilateral grave de IR e avaliar a recuperação funcional renal por meio da realização de nefrectomia contralateral oito dias após a lesão original. Usando essa abordagem, 90 a 100% dos camundongos sobrevivem à lesão, mas o mais importante é que os camundongos desenvolveram lesão renal muito consistente e podem ser avaliados quanto à recuperação funcional após lesão renal aguda a partir do nono dia.

A consistência e previsibilidade da lesão renal é fortemente dependente da consistência e precisão das etapas realizadas durante a cirurgia. Uma vez dominado, essa técnica pode ser feita em 35 a 40 minutos e pode ser executada simultaneamente em cinco a 10 milhas de cada vez. Usamos esse método para operar em até 40 a 50 milhas por dia, então aproveite e boa sorte.