Injeção Intraductal para localizada Drug Delivery ao Rato glândula mamária

O objetivo geral deste procedimento é fornecer reagentes aquosos de forma não invasiva à glândula mamária de camundongo. Introdutório. Isso é feito primeiro anestesiando o mouse e removendo os pelos ao redor dos mamilos. O segundo passo é remover a pele morta que cobre a ponta dos mamilos usando uma micropinça

Em seguida, uma solução aquosa é injetada no mamilo usando uma agulha de calibre 33. A etapa final é garantir que a injeção foi bem-sucedida, observando o local da injeção em busca de inchaço potencial, o que sugeriria uma injeção de almofada de gordura mamária em vez de uma injeção na glândula mamária. Em última análise, o sucesso do procedimento pode ser determinado pela visualização da árvore dúctil após a injeção de azul de Evans.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de mama, como a contribuição de genes específicos durante vários estágios da tumorgênese da memória. Para começar, prepare 160 microlitros de corante azul de Evans 0,2% em solução salina tamponada com fosfato estéril para cada camundongo a ser injetado antes da injeção. Pese cada rato e registre seu peso corporal.

Em seguida, anestesie o mouse um de cada vez, usando uma câmara de flúor isof e aplique lubrificante para os olhos. Uma vez sedado, coloque um nariz de flúor isof e injete meloxicam de cinco a 10 miligramas por quilograma por via subcutânea antes do procedimento Como analgésico durante o procedimento, monitore continuamente o camundongo quanto a alterações na frequência respiratória e ajuste o nível de isof flúor de acordo, especialmente se a frequência respiratória do camundongo indicar que o nível de anestesia precisa ser reduzido. Em seguida, prepare a área do mamilo para injeção aplicando um creme depilatório de venda livre.

Aguarde cinco minutos e remova suavemente os pelos soltos com o aplicador de ponta de algodão. Usando um movimento circular, remova qualquer resíduo de creme usando toalhas de papel úmidas com água morna. Em seguida, prenda o mouse sob o estereoscópio prendendo suavemente as extremidades e limpe os locais de injeção com compressas embebidas em álcool.

Para começar, localize os mamilos a serem injetados sob o estereoscópio. Em seguida, use uma pinça de microdissecação fina para remover qualquer pele morta que cubra a abertura do mamilo. Não é necessário cortar o mamilo para a injeção.

Em seguida, carregue 11 microlitros de solução injetável em uma seringa de 50 microlitros equipada com uma agulha de cubo de metal de calibre 33 afixada a ela. Um microlitro do fluido de injeção geralmente vaza após a injeção, resultando na meta final de 10 microlitros de soluções injetadas com sucesso. Segure o mamilo suavemente com a pinça fina e levante-o ligeiramente para posicioná-lo para a injeção.

Em seguida, injete 11 microlitros em cada glândula no primeiro e no último par de glândulas mamárias, pois elas requerem um volume menor do que os pares intermediários para preencher totalmente a árvore dúctil da glândula. Em seguida, injete 21 microlitros em cada glândula do segundo ao quarto par de glândulas mamárias. A taxa de injeção deve ser mantida em aproximadamente 40 microlitros por minuto para minimizar qualquer dano potencial causado por fluido em movimento rápido dentro dos lúmens ductais.

Após a injeção. Observe o local da injeção. Não deve haver sinais de trauma na região do mamilo ou no tecido circundante.

Inchaço na área ao redor do mamilo. Provavelmente indica uma injeção de almofada de gordura mamária em vez de uma injeção ductal bem-sucedida. Em seguida, remova o animal do cone do nariz e mova-o para uma gaiola separada para recuperação.

Coloque a gaiola sob uma lâmpada de calor para evitar hipotermia e ajudar na recuperação. Alojar o animal individualmente e monitorá-lo de perto até que recupere a consciência e a mobilidade. Após a conclusão do estudo, eutanasiar os camundongos por luxação cervical após gás comprimido de CO2 em uma câmara isolada.

Em seguida, excise as glândulas mamárias e continue com o manuseio adequado da amostra para a análise de interesse. Aqui é mostrada a glândula mamária de um camundongo antes e depois de ser injetada através do mamilo com o corante azul de Evan. A região do mamilo não apresenta inchaço ou dano tecidual, que seria causado pela injeção do corante na almofada de gordura ao redor dos dutos.

O corante azul difuso visto na imagem à direita é um bom indicador de uma injeção correta. Isso pode ser validado observando toda a glândula ou uma seção transversal após a excisão da glândula. Em toda a análise de montagem mostrada aqui, a glândula injetada azul de Evans mostra toda a glândula cheia de corante sem danificar as estruturas nativas do pato.

Isso é confirmado com Carmen Dye, que também destaca as estruturas dúcteis. Também é possível utilizar este método para a entrega de moléculas terapêuticas, como irna, às células ductais. Na imagem mostrada aqui, um irna marcado com fluorescência que tem como alvo o preenchimento falciforme, um gene não essencial foi injetado e, em seguida, o tecido foi fotografado 48 horas depois para mostrar a localização das moléculas.

Seguindo este procedimento. Outros métodos, como o knockdown de SRNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas ao papel de um determinado gene no desenvolvimento da memória ou tumorgênese.