Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D

O objetivo geral do experimento a seguir é observar a morfologia das células cancerígenas e sua interação com a matriz extracelular em culturas 3D, isso é conseguido primeiro marcando o colágeno da cauda de rato, um com o DTRA fluorescente vermelho para permitir a visualização das redes de colágeno 3D. Na segunda etapa, as células cancerígenas cultivadas como células únicas ou esteróides multicelulares são incorporadas nas matrizes de colágeno marcadas com Tamra 3D. As células são então dispersas por todo o colágeno por um a três dias, imitando a invasão e migração de células cancerígenas para os três estromas DS circundantes in vivo.

Em seguida, as células são fixadas e imunocoradas com os anticorpos e Phin apropriados para visualizar a morfologia celular e a localização das proteínas de interesse. Em última análise, a morfologia distinta das células cancerígenas cultivadas em 3D e sua interação com a matriz extracelular 3D podem ser analisadas através da aquisição de Zacks profundos das amostras por microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da migração celular, contribuindo para uma melhor descrição da função de composição molecular e localização de componentes celulares em ambientes 3D que por muitos anos foram analisados em 2D.

Demonstrando este procedimento comigo estará Anton Smo, um técnico em nosso laboratório Para rotular o colágeno um com Tamara. Comece enchendo lentamente uma seringa descartável de um mililitro com um mililitro de colágeno de cauda de rato altamente concentrado, uma solução evitando bolhas de ar. Conecte uma agulha hipodérmica de calibre 21 e, em seguida, injete o colágeno em um de diálise de três mililitros pré-embebido com um corte de peso molecular de proteína Dalton de 10.000, tomando cuidado para não danificar a membrana com a agulha.

Puxe o êmbolo para trás para remover todo o ar do e, em seguida, dialise o colágeno durante a noite contra um litro de tampão de rotulagem. Na manhã seguinte, remova cuidadosamente o colágeno do de diálise e, em seguida, misture um mililitro da solução de colágeno dialisado com um mililitro de solução de Tamra fria recém-diluída em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Enrole o tubo em papel alumínio e incube durante a noite com rotação.

Na manhã seguinte, transfira o colágeno marcado com TAMRA para um de diálise pré-embebido e dialise o colágeno durante a noite contra um litro de tampão de rotulagem para remover o excesso de corante. Em seguida, para preservar o colágeno marcado com Tamara, coloque o de diálise em um litro de 0,2% de volume por volume, solução de ácido acético com pH de quatro e dialise o durante a noite. Novamente, na manhã seguinte, transfira o colágeno marcado com Tamara do de diálise para um tubo de microcentrífuga usando uma micropipeta, meça o volume final do colágeno e, em seguida, calcule a concentração final do colágeno marcado com Tamara.

Considerando o volume inicial e a concentração da solução de colágeno utilizada e armazenada a DY colágeno a quatro graus Celsius, protegida da luz para incorporação de células individuais. Determine o volume de dois miligramas por mililitro. Mistura de colágeno Tamara necessária para o experimento e, em seguida, misture os volumes apropriados de 10 XPBS e um hidróxido de sódio normal.

Em seguida, misture os volumes apropriados de colágeno marcado com Tamara e colágeno não marcado em uma proporção de um para seis para atingir uma concentração final de colágeno total de dois miligramas por mililitro. Agora suspenda as células de interesse no volume apropriado de meio celular resfriado sem FBS e, em seguida, adicione as células à mistura de colágeno Terah para obter uma densidade celular final de uma vez 10 elevado à quinta célula por mililitro. Confirme o pH testando 10 microlitros da mistura em uma tira de teste de pH e, em seguida, pipete gotas de 100 microlitros da suspensão de células de colágeno Tamara em pratos com fundo de vidro, permitindo que a mistura polimerize em temperatura ambiente até que o colágeno se transforme em um gel esbranquiçado cerca de 30 a 45 minutos.

Em seguida, adicione cuidadosamente meio de cultura suficiente para cobrir as gotas de células incorporadas ao colágeno e mantenha as gotas a 37 graus Celsius em 10% de dióxido de carbono por tempo suficiente para que as células migrem por toda a matriz. Normalmente um a três dias para incorporar esteróides celulares. Pipete gotas de 100 microlitros de colágeno térico recém-diluído.

Misture em pratos com fundo de vidro e deixe o colágeno iniciar a polimerização por dois a cinco minutos para aumentar ligeiramente a viscosidade do gel. Em seguida, colete um esteróide celular e coloque-o em uma placa de Petri fresca. Remova qualquer excesso de líquido e ressuspenda o esteróide em 10 microlitros de mistura de colágeno Tamara para evitar a diluição do colágeno dentro do meio celular.

Em seguida, use uma pipeta P 20 para coletar o esteróide suspenso de colágeno e coloque-o no centro da parte superior da gota de mistura de colágeno TEMA de 100 microlitros. Deixar o colágeno polimerizar brevemente por dois a cinco minutos geralmente é suficiente para garantir que seu OID esteja a mais de cem mícrons de distância da parte superior e inferior da gota de colágeno. Mas se o seu esteróide ainda afundar, tente inverter o prato por cerca de dois minutos e depois girá-lo para a posição vertical.

Deixe o colágeno polimerizar como acabou de demonstrar e, em seguida, adicione cuidadosamente meio de cultura suficiente para cobrir as gotas de esteróides de colágeno. Em seguida, incube as gotas para permitir que as células migrem por toda a matriz para coloração imunofluorescente. Comece removendo cuidadosamente os meios celulares e enxaguando as matrizes de colágeno incorporadas com esteróides com PBS.

Em seguida, incube as células com tampão de fixação de extração. Após mais cinco minutos, fixe as células com PFA e sacarose em PBS por 30 minutos. Em seguida, enxágue as células.

Agora incube as células com os anticorpos primários de interesse diluídos em PBS. Em seguida, lave as matrizes três vezes por 30 minutos de cada vez. Após a terceira lavagem, incubar as matrizes com os anticorpos secundários, Phin conjugado com Alexa e DPI diluído em PBS.

Depois de lavar as matrizes novamente, remova o excesso de líquido e adicione cerca de 500 microlitros de mídia de montagem preenchendo o fundo da louça. Agora sele cada gota com uma lamínula de 24 milímetros, tomando cuidado para não pressionar as gotas e danificar a estrutura das matrizes. Para criar imagens das amostras.

Posicione a objetiva de 40 x no meio da gota de colágeno. Em seguida, usando a lâmpada fluorescente, obtenha uma visão geral da amostra tanto no eixo XY quanto no eixo xz. Em seguida, mude para o modo de imagem ao vivo confocal.

Usando o laser de 561 nanômetros, comece a focar a partir da parte inferior do vidro até que as fibras de colágeno comecem a aparecer. Considere que esta profundidade Z é igual a zero micrômetros. Agora levante a objetiva até atingir 100 micrômetros acima de Z igual a zero e, em seguida, imagine as células encontradas em z igual a 100 micrômetros ou acima para evitar quaisquer efeitos de tensão do fundo de vidro rígido rotulando o colágeno de cauda de rato com Tamara permite uma fácil preparação e visualização de redes de colágeno 3D.

A polimerização lenta à temperatura ambiente permite a formação dessas redes visualizadas aqui em vermelho com uma organização comparável às encontradas in vivo proteínas do citoesqueleto como a tubulina, que aparecem aqui em azul ou uma actina mostrada aqui em verde, podem ser visualizadas por imunocoloração como demonstrado nessas imagens quando visualizadas em matrizes 3D, As células CT 26 do adenocarcinoma de cólon apresentam uma morfologia mesenquimal típica caracterizada por um corpo celular alongado com saliências celulares ricas em actina que se assemelham a Filip Podia e lam podia. Essa morfologia alongada é ainda mais evidente nas células que tentam escapar do esteróide celular invadindo a matriz de colágeno. Após dois dias em cultura, as células começam a invadir a matriz 3D de colágeno, afastando-se do esteróide celular.

É crucial analisar as pilhas Z coletadas de todos os planos de visão para garantir uma distribuição 3D uniforme das células nessas imagens. Por exemplo, quando visualizadas como uma projeção XY máxima, as células CT 26 cultivadas como esteróides parecem invadir extensivamente a matriz de colágeno 3D. No entanto, a visão x XZ revela que as células estão realmente invadindo um intervalo Z restrito em comparação com o volume de esteróides, sugerindo uma região preferencial de invasão.

Este esteróide representativo foi de fato colocado muito perto do fundo de vidro do prato, resultando na migração das células para longe do esteróide, não invadindo a matriz de colágeno 3D, mas rastejando no vidro rígido 2D após este procedimento. Outros métodos, como imagens ao vivo de células que expressam GFP incorporadas em matrizes de colágeno TAMRA, podem ser usados para acompanhar de perto as interações dinâmicas entre a célula e a matriz ou a deformação da matriz induzida por células.